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0 vues • 4:02 min • April 30th, 2023
Les neurosphères sont des agrégats sphériques non adhérents de cellules précurseurs neurales ou NPC.
Lorsqu’ils sont mis en boîte dans des conditions de culture adhérentes spécifiques, les NPC peuvent migrer spontanément hors de la neurosphère.
Pour évaluer la réponse migratoire des CPN, il faut d’abord préparer une suspension de CPN de la densité souhaitée dans un milieu approprié.
Ensuite, ensemencez la suspension cellulaire dans une plaque de culture contenant un milieu et incuberez.
Les facteurs de croissance spécifiques dans le milieu favorisent la prolifération des cellules. De plus, l’absence de substrat de revêtement maintient les cellules en suspension dans les milieux, ce qui les aide à former des agrégats cellulaires 3D appelés neurosphères.
Une fois atteint la taille souhaitée, collectez les neurosphères.
Centrifuger et remettre en suspension la pastille de neurosphère dans le milieu dilué.
Ensuite, plaquez la suspension de la neurosphère dans une plaque recouverte d’une matrice extracellulaire contenant un milieu dilué et incuber.
Pendant la culture, les neurosphères adhèrent à la matrice extracellulaire.
Au fil du temps, en raison des constituants de la matrice extracellulaire, quelques NPC commencent à migrer loin du noyau de la neurosphère.
Maintenant, retirez le support et fixez les cellules.
Capturez des images en contraste de phase des neurosphères présentant une migration cellulaire.
À l’aide d’un logiciel approprié, mesurez l’aire de la neurosphère totale et la masse cellulaire interne.
Enfin, soustrayez l’aire de la masse cellulaire interne de l’aire totale de la neurosphère pour calculer la migration moyenne des NPC de la neurosphère.
Pour former la neurosphère, pipetez 1 millilitre de média d’expansion à 100 % dans une boîte de 35 millimètres sans aucun substrat de revêtement. Ensuite, ajoutez un million de cellules précurseurs neurales dans chacune de ces plaques et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 à 96 heures.
Pour préparer la plaque à la migration de la neurosphère, dissoudre les aliquotes de gel imitant l’ECM dans 6 millilitres de milieu d’expansion à 30 %. Ajoutez 1 millilitre de gel mimique ECM avec 30 % de milieu d’expansion dans un seul puits d’une plaque à 6 puits. Ensuite, incubez l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.
Pour plaquer les neurosphères, utilisez une pipette pour collecter les cellules du milieu à partir de la boîte de 35 millimètres et les transférer dans un tube conique. Ensuite, faites tourner le tube à 100 x g pour granuler les neurosphères. Ensuite, remettre la pastille en suspension dans 1 à 3 millilitres de milieu d’expansion préchauffé à 30 %.
Ensuite, pipetez 200 microlitres des neurosphères remises en suspension dans la plaque à 6 puits contenant le gel mimétique ECM avec 30 % de milieu d’expansion et basculez la plaque. Ensuite, incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 48 heures. Aspirez le gel mimique ECM avec un milieu d’expansion à 30 %, puis fixez les cellules pendant 30 minutes avec du paraformaldéhyde à 4 %.
Pour analyser les neurosphères, capturez des images à l’aide des paramètres de contraste de phase à un grossissement de 10X. Utilisez le logiciel NIH ImageJ pour mesurer la migration moyenne des neurosphères. Sur ImageJ, utilisez l’outil de ligne à main levée pour tracer le contour externe de la neurosphère.
Ensuite, utilisez la fonction de mesure pour calculer l’aire de trace et tracer la masse cellulaire interne de la sphère. Soustrayez la masse cellulaire interne de la surface totale de la neurosphère pour quantifier la migration moyenne.