Culture de cellules endothéliales à partir de microvaisseaux cérébraux de rat : une procédure pour isoler et cultiver des cellules endothéliales à partir de microvaisseaux de cerveau de rat

Pour isoler les cellules endothéliales du cerveau, transférez d’abord un cerveau de rat récolté dans une boîte contenant un tampon réfrigéré.

Après avoir enlevé le cervelet et les nerfs optiques, divisez le cerveau en hémisphères cérébraux. Ensuite, séparez le mésencéphale du cerveau antérieur.

Retirez les méninges et la substance blanche contenant de la myéline du cerveau antérieur, laissant derrière le cortex cérébral pour isoler les microvaisseaux.

Ensuite, homogénéisez le cortex pour briser le tissu nerveux et les constituants.

Centrifuger l’homogénat pour éliminer les débris cellulaires et la myéline.

Par la suite, traitez la pastille tissulaire avec un cocktail de digestion contenant des enzymes de collagénase, de dispase et de désoxyribonucléase.

Les collagénases et les dispasses digèrent la matrice extracellulaire qui intègre les microvaisseaux, détachant les fragments de microvaisseaux du tissu. Les désoxyribonucléases dégradent tout ADN libre libéré par les cellules lysées.

Mélangez le volume souhaité d’homogénat digéré avec un milieu à gradient de densité approprié et centrifugez.

Jetez la couche supérieure contenant de la myéline et du parenchyme cérébral, suivie du surnageant.

Maintenant, traitez la pastille contenant des microvaisseaux avec le cocktail de digestion pour libérer complètement les fragments de microvaisseaux comprenant les cellules endothéliales et les péricytes.

Centrifuger la suspension. Remettez en suspension la pastille contenant un fragment de microvaisseau dans un milieu approprié complété par de la puromycine - un antibiotique.

Ensemencez la suspension dans une plaque recouverte de protéines de matrice extracellulaire et incuberez.

Les fragments de microvaisseaux adhèrent au revêtement de la plaque. Puromycine élimine sélectivement les péricytes, tandis que les composants multimédias facilitent la prolifération des cellules endothéliales.

Retirez le cerveau du crâne de trois rats Wistar âgés de 5 semaines et transférez les cerveaux dans une boîte de Pétri remplie d’un tampon de dissection froid maintenu sur de la glace.

Disséquez les cerveaux sans le cervelet et les nerfs optiques. Ensuite, coupez chaque cerveau en deux pour séparer les deux hémisphères cérébraux.

Sous le stéréomicroscope, faites une autre incision pour enlever le mésencéphale et transférez tous les cerveaux antérieurs dans une boîte de Pétri propre sur glace avec un tampon de dissection.

Ensuite, transférez un cerveau antérieur dans une nouvelle boîte de Pétri remplie d’un tampon de dissection froid. Tenez-le avec la pince et détachez soigneusement les méninges des bords du cerveau antérieur.

Ensuite, retournez le cerveau antérieur et retirez soigneusement les méninges sans les déchirer. Assurez-vous que le cerveau antérieur est débarrassé des méninges et coupez la partie restante des nerfs optiques. Le but de cette étape est d’enlever la couette de matière blanche pour obtenir une coquille de cortex.

Commencez par serrer le cerveau antérieur sur le bord, puis faites glisser délicatement la pince le long de la surface, en prenant soin de ne pas déchirer la surface du cortex.

Ensuite, assurez-vous que le cerveau est exempt de méninges en le retournant pour vérifier qu’il n’y a pas de méninges résiduelles ou de gros vaisseaux de surface.

Ensuite, en commençant par l’extraction des trois cerveaux de leur crâne, le temps total pour la dissection ne devrait pas prendre plus de 2 heures pour la préservation des tissus et la survie cellulaire. Transférez les cortex de trois cerveaux dans 6 millilitres de tampon de dissection froide dans un homogénéisateur Dounce de 7 millilitres.

Par la suite, dissociez les cortex avec 10 mouvements de haut en bas avec le premier pilon de dégagement plus grand, suivis de 10 coups de haut en bas avec le deuxième pilon de dégagement plus petit.

Ensuite, transférez 6 millilitres de suspension dans un nouveau tube Falcon de 50 millilitres et lavez l’homogénéisateur Dounce avec 24 millilitres de tampon de dissection à froid. Divisez la suspension en trois tubes Falcon pour obtenir l’équivalent d’un cortex par tube.

Ensuite, centrifugez à 1000 x g pendant 5 minutes à température ambiante. L’observation de la pastille montre un dégradé de couleur rose, qui représente la partie microvasculaire de l’homogénat des cortex.

Maintenant, jetez le surnageant et homogénéisez la pastille d’un cortex avec 1 millilitre de solution enzymatique contenant un mélange de collagénases, de dispase, de DNase de type 1 et de gentamicine.

Placez les tubes dans un shaker pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, mélangez 1 millilitre de digest avec 10 millilitres de BSA/HBSS 1X à 25 % et agitez doucement les tubes. Ensuite, séparez-les par centrifugation dépendante de la densité à 3 600 x g pendant 15 minutes à température ambiante.

Après la centrifugation dépendante de la densité, la pastille contient les microvaisseaux et le disque supérieur contient de la myéline, du parenchyme cérébral et des microvaisseaux résiduels.

Transférez soigneusement le disque supérieur et le surnageant dans des tubes Falcon propres de 50 millilitres ; veillez à ne pas aspirer la pastille du microrécipient.

Tourbillonnez doucement le tube et répétez la centrifugation dépendante de la densité. Au cours de cette deuxième centrifugation, maintenez la pastille résultante contenant les microrécipients à 4 degrés Celsius.

Après la deuxième centrifugation dépendante de la densité, jeter soigneusement le disque supérieur et le surnageant. Mélangez et remettez en suspension les granulés obtenus contenant les microrécipients des deux centrifugations avec 1 millilitre de HBSS 1X froid.

Ensuite, lavez les microrécipients avec 20 millilitres de HBSS 1X froid et centrifugez-les à 1 000 x g pendant 5 minutes. Ensuite, jetez le surnageant en prenant soin de ne pas perdre la pastille de microvaisseau.

Homogénéiser la pastille de microvaisseau d’un cortex avec 1 millilitre de la même solution enzymatique en suivant un léger vortex des tubes. De plus, digérez les microvaisseaux pendant 1 heure à 37 degrés Celsius dans un agitateur. Après cela, mélangez les microvaisseaux digérés des trois cortex dans un tube.

Encore une fois, séparez le mélange en deux tubes Falcon de 50 millilitres pour obtenir les microvaisseaux extraits de l’équivalent d’un cortex et demi par tube. Ensuite, centrifugez à 1 000 x g pendant 5 minutes à température ambiante.

Juste avant de plaquer les microvaisseaux, prélever deux flacons enduits T75 de l’incubateur et aspirer l’excédent de revêtement. Jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille de microvaisseau dans 1 millilitre d’ECM.

Amenez chaque tube à 10 millilitres avec ECM complété par 4 microgrammes par millilitre de puromycine pour commencer le processus de purification et plaquez les microvaisseaux dans le flacon.

Ensuite, placez les flacons dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pour permettre l’adhésion des microvaisseaux à la matrice collagène-fibronectine.