Génération de cellules souches neurales induites (iNSC) à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMNC) : une procédure basée sur le virus Sendai pour reprogrammer les PBMNC en iNSCs

Pour reprogrammer les cellules somatiques en cellules souches neurales induites ou iNSC - des cellules souches possédant une capacité d’auto-renouvellement et de différenciation élevée, commencez par cultiver des cellules mononucléées du sang périphérique dans un milieu sans sérum pour développer les érythroblastes.

Ensuite, pipetez la suspension d’érythroblaste dans une plaque de culture. Traitez les cellules avec le virus Sendai recombinant ou SeV. Ces virus codent pour reprogrammer des facteurs de transcription. Centrifuger pour sédimenter les cellules et incuber.

Après la fusion du SeV avec la membrane de la cellule hôte, le génome du virus subit une transcription suivie d’une traduction dans le cytoplasme. L’expression ectopique des facteurs de transcription déclenche le processus de reprogrammation cellulaire sans intégrer les gènes dans le génome de l’hôte.

Maintenant, centrifugez la culture pour éliminer les virus. Remettre en suspension les cellules transduites dans un milieu approprié, puis placage. De plus, centrifuger pour éliminer les débris cellulaires. Remettez les cellules en suspension dans le milieu iNSC.

Ensuite, ensemencez les cellules dans une plaque recouverte de protéines. Les cellules se fixent à l’enrobage protéique de la plaque. Complétez les cellules collées avec un milieu iNSC un jour sur deux. Après une semaine de culture, remplacez quotidiennement le support usagé par du support iNSC frais.

Les facteurs de croissance et les constituants chimiques du milieu maintiennent l’auto-renouvellement et soutiennent la pluripotence d’un sous-ensemble de cellules transduites, en les reprogrammant complètement en iNSC. Au fil du temps, les cellules commencent à former des colonies d’iNSC. Sélectionnez les colonies souhaitées pour la culture.

Le jour 0, collectez les cellules dans un milieu MNC et transférez-les dans un tube conique de 15 millilitres. Après avoir centrifugé les cellules à 200 x g pendant 5 minutes, aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension avec 1 millilitre de milieu MNC préchauffé. Comptez les cellules viables avec du Trypan Blue, puis remettez-les en suspension avec un milieu MNC préchauffé jusqu’à une concentration de 200 000 cellules par puits dans des plaques à 24 puits.

Décongelez les tubes retirés de l’entrepôt à moins 80 degrés Celsius contenant le virus Sendai dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 5 à 10 secondes, puis laissez-les décongeler à température ambiante. Une fois décongelés, placez-les immédiatement sur de la glace. Ajoutez le virus de Sendai dégelé dans les puits de la plaque de 24 puits avec des multinationales à une multiplicité d’infection de 10. Pour faciliter la fixation des cellules, centrifugez les plaques à 1 000 x g pendant 30 minutes, puis placez les plaques dans l’incubateur à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone.

Le jour 1, transférez les cellules avec le fluide dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Pour détacher davantage les cellules restantes, rincez les puits avec 1 millilitre de milieu MNC par puits et ajoutez les cellules avec le milieu dans le tube. Après avoir centrifugé cette suspension cellulaire à 200 x g pendant 5 minutes, aspirez le surnageant, remettez les cellules en suspension avec 500 microlitres de milieu MNC frais préchauffé et ajoutez-les dans un puits d’une plaque de 24 puits.

Le jour 2, utilisez 1 millilitre par puits de 50 microgrammes de poly-D-lysine et de D-PBS préalablement dilués par microlitre pour enduire les plaques à 6 puits pendant au moins 2 heures à température ambiante. Aspirez la poly-D-lysine des plaques à 6 puits et séchez-la sur le banc propre vertical pendant environ 10 minutes. Ensuite, ajoutez 1 millilitre par puits de laminine de 5 microgrammes par millilitre préalablement dilué dans les plaques à 6 puits et incubez pendant 4 à 6 heures à 37 degrés Celsius pour enrober. Lavez les plaques avec du D-PBS avant utilisation.

Le jour 3, toutes les MNC transduites par le virus Sendai dans un milieu de cellules souches neurales induites sur des plaques à 6 puits recouvertes de poly-D-lysine laminine. Les jours 5 et 7, ajoutez doucement 1 millilitre de milieu iNSC préchauffé à 37 degrés Celsius dans chaque puits des plaques à 6 puits.

Du jour 9 au jour 28, remplacez quotidiennement le milieu par du milieu iNSC frais préchauffé. Surveiller l’émergence des colonies d’iNSC et, dans environ 2 à 3 semaines, choisir les colonies avec la morphologie appropriée à l’aide de pipettes en verre brûlé. Ensuite, transférez chaque colonie dans un puits séparé d’une plaque à 6 puits pour l’expansion.