Analyse automatisée de la distribution de la taille des fragments d’ADN de cf basée sur l’électrophorèse capillaire : une méthode basée sur une micropuce d’ADN pour étudier la distribution de la taille de fragments d’ADN isolés à partir de biofluides
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0 vues • 4:48 min • July 8th, 2025
Une cellule mourante libère des fragments d’ADNf à l’extérieur de la cellule. Pour analyser la distribution de la taille des fragments d’ADNcf, commencez par une puce à ADN multipuits - un système électrophorétique capillaire miniature. Chaque puits de la puce contient de nombreux canaux de séparation microfluidique à sa base.
Chargez la matrice de gel polysaccharidique et le mélange de colorant de fluorescence dans le puits désigné sur la puce. Positionnez la puce sur l’ensemble d’amorçage équipé d’une seringue vide. Fermez l’ensemble d’amorçage et appuyez sur le piston pour créer une pression vers le bas. Cela facilite l’entrée du gel visqueux du puits dans le canal de séparation respectif.
Ouvrez l’ensemble et remplissez les puits restants avec une suspension d’ADNcf et une échelle d’ADN de la gamme de taille connue. Montez la puce sur l’analyseur de fragments. La forte tension entraîne l’entrée de la suspension d’ADNcf des puits d’échantillon dans le canal de séparation préchargé avec une matrice de gel, où l’ADN est coloré avec le colorant.
Lorsque l’ADN se déplace de la cathode vers l’anode, les petits fragments d’ADN migrent plus rapidement à travers le gel tandis que les plus gros fragments se déplacent plus lentement. Cela conduit à une séparation des fragments d’ADN en fonction de la taille. Le détecteur détecte la fluorescence relative des fragments, la compare à l’échelle d’ADN et génère un électrophérogramme - un graphique indiquant la distribution de la taille de l’ADNcf.
Pour analyser la taille des fragments d’ADN, fixez d’abord la plaque de base à la station d’amorçage de la puce et ajustez le clip à la position la plus basse. Placez une nouvelle puce d’ADN haute sensibilité sur la station d’amorçage de la puce et ajoutez 9 microlitres de mélange gel-colorant au fond du puits de la puce G. Positionnez le piston à 1 millilitre et fermez la station d’amorçage des copeaux. Fermez le verrou du loquet jusqu’à ce qu’il s’enclenche, réglez la minuterie sur 60 secondes et appuyez sur le piston jusqu’à ce qu’il soit maintenu par le clip.
Après exactement 60 secondes, utilisez le mécanisme de déverrouillage du clip pour libérer le piston. Lorsque le piston recule jusqu’à au moins 300 microlitres, attendez 5 secondes avant de rétracter lentement le piston en position 1 millilitre. Ouvrez la station d’amorçage de la puce pour prélever 9 microlitres du mélange gel-colorant et transférez le gel au fond du puits de la puce à ADN haute sensibilité 'G'.
Pour charger le marqueur d’ADN, versez 5 microlitres de marqueur d’ADN dans le puits de l’échelle et dans les 11 puits d’échantillons. Pour charger l’échelle et les échantillons, ajoutez 1 microlitre de l’échelle d’ADN dans le puits de l’échelle d’ADN, 1 microlitre d’échantillon dans les puits d’échantillon utilisés et 1 microlitre de marqueur dans les puits d’échantillon inutilisés. Placez la puce d’ADN haute sensibilité horizontalement dans l’adaptateur pour 60 secondes de vortex à 2 400 tours par minute, en veillant à ce que le renflement qui fixe la puce d’ADN haute sensibilité ne soit pas endommagé.
Après le vortex, vérifiez que la cartouche d’électrode est correctement insérée et que le sélecteur de puce est positionné sur l’ADN double brin haute sensibilité. Montez soigneusement la puce d’ADN haute sensibilité dans le réceptacle et vérifiez que la cartouche d’électrode est bien insérée dans les puits de la puce avant de fermer le couvercle. L’écran du logiciel de l’analyseur de fragments affichera une icône de puce pour indiquer que la puce a été insérée et que le couvercle a été fermé.
Pour lancer l’analyse, ouvrez le menu des tests et sélectionnez le test d’ADN double brin à haute sensibilité. Entrez les noms des exemples dans le tableau et cliquez sur « Démarrer » pour lancer l’exécution de la puce. À la fin du cycle, retirez et jetez immédiatement la puce conformément aux bonnes pratiques de laboratoire.
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'analyse de la distribution de taille des fragments d'ADN circulant (cfDNA) libérés par des cellules en cours de mort, à l'aide d'une puce ADN multipuits. Le processus consiste à charger une matrice de gel et des échantillons d'ADN circulant dans la puce, suivis d'une séparation électrophorétique selon la taille des fragments.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Biologie moléculaire
- Génomique
Contexte
- L'ADN libre de cellules (cfDNA) est libéré par les cellules en cours de mort et peut fournir des informations sur les processus cellulaires.
- L'analyse de la distribution des tailles de l'ADN libre de cellules peut aider à comprendre diverses conditions biologiques.
- L'électrophorèse est une technique courante utilisée pour l'analyse des fragments d'ADN.
- Les puces à ADN multipuits facilitent l'analyse à haut débit des échantillons.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour analyser la distribution de taille des fragments d’ADN circulant.
- Utiliser une puce d’ADN multipuits pour une séparation et une détection efficaces des fragments d’ADN.
- Fournir un protocole facile à suivre dans des conditions de laboratoire.
Méthodes utilisées
- Préparation d'une puce d'ADN multipuits avec une matrice de gel et un colorant fluorescent.
- Chargement des échantillons d'ADN circulant et d'une échelle d'ADN dans les puits désignés.
- Séparation électrophorétique des fragments d'ADN selon leur taille.
- Analyse des tailles de fragments à l'aide d'un analyseur de fragments et d'un logiciel.
Résultats principaux
- Une séparation réussie des fragments d'ADN circulant selon leur taille a été réalisée.
- L'électrophérogramme obtenu a révélé des profils clairs de distribution des tailles.
- La méthode a démontré une haute sensibilité et une bonne reproductibilité.
- Les résultats peuvent être utilisés pour des études biologiques et cliniques ultérieures.
Conclusions
- La méthode développée est efficace pour analyser les tailles des fragments d'ADN circulant.
- Les puces d'ADN multipuits peuvent améliorer le débit dans l'analyse de l'ADN circulant.
- Cette technique peut être appliquée dans divers contextes de recherche et cliniques.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle
Électrophorèse capillaire automatisée permet une détermination précise de la taille des fragments d'ADN circulant, soutenant la validation ciblée dans la découverte de biomarqueurs en oncologie. Cette méthode fournit des données quantitatives sur la distribution de taille qui aident à réduire les risques mécanistiques des tests de biopsie liquide. Elle améliore la confiance prédictive en phase précoce de découverte en reliant les profils de fragments aux mécanismes biologiques de mort cellulaire.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des voies apoptotiques par le profilage de la taille de l'ADN circulant.
- Valeur opérationnelle : Facilite la validation fonctionnelle des cibles en corrélant les motifs de fragmentation aux processus cellulaires.
- Valeur prédictive : Améliore le tri des portefeuilles en fournissant des informations mécanistiques sur la mort cellulaire induite par les médicaments.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques standardisés pour le criblage en aval de biomarqueurs d'ADN circulant.
- Valeur opérationnelle : Garantit la reproductibilité des tests grâce à une séparation par taille et à une quantification par électrophérogramme.
- Extensibilité : Facilite la réutilisation de la plateforme dans plusieurs flux d'échantillons avec une précision constante du dimensionnement.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Relie l'analyse de l'ADN circulant en phase de découverte à la validation préclinique par l'intermédiaire de références en matière de distribution de taille.
- Décisions adaptées au risque : Soutient les critères de progression en définissant des seuils de taille des fragments associés à une activité biologique.
- Réduction du risque mécanistique : Met l'accent sur la valeur prédictive du dimensionnement de l'ADN circulant dans le suivi des mécanismes de réponse thérapeutique.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Cette méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, allant du test d'hypothèse à l'identification de composés candidats, en fournissant des données de dimensionnement qui éclairent la pertinence d'un biomarqueur.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur les mécanismes de mort cellulaire par l'analyse de la taille des fragments.
- Screening : Assure la préparation du test grâce à des sorties électrophorétiques reproductibles pour la quantification de l'ADN circulant.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives de taille permettant des comparaisons entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien avec la continuité préclinique grâce à des profils de taille standardisés applicables dans les modèles de maladies.
- Réutilisation institutionnelle : Positionne la puce microfluidique comme une plateforme réutilisable pour l'analyse de l'ADN circulant dans divers projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique concernant l'origine de l'ADN circulant.
- Valeur opérationnelle : Assure la standardisation, la reproductibilité et la scalabilité des protocoles de dimensionnement des fragments.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions d'aller/arrêt en permettant une évaluation fondée sur les données de l'activité biologique.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque grâce à des métriques objectives de distribution des tailles d'ADN circulant.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation de puces microfluidiques et les principes de séparation électrophorétique.
- Dépend de l'instrumentation d'analyseur de fragments et de puces ADN haute sensibilité compatibles.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles de chargement des échantillons et de préparation du gel-colorant.
- Implique des considérations d'adaptation lors du passage à différents types d'échantillons de biofluides.
- Comprend des limitations pratiques telles que la consommabilité des puces et les contraintes d'utilisation unique par essai.
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Dernière mise à jour : 29 août 2026