Préparation d’un échafaudage ensemencé par CSM : une technique pour préparer un échafaudage ensemencé de cellules souches mésenchymateuses en vue d’une implantation chirurgicale dans un modèle murin

Les cellules cancéreuses produisent des facteurs chimiotactiques pour attirer les cellules souches mésenchymateuses ou CSM des vaisseaux sanguins vers l’emplacement de la tumeur.

Pour étudier l’effet de ces cellules sur la croissance tumorale in vitro, commencez par prendre un substrat d’échafaudage stérilisé. Transférez-le sur une plaque contenant le fluide souhaité pour pré-mouiller l’échafaudage. Placez-le sur une surface sèche pour enlever l’excès de média collé à l’échafaudage pour une meilleure adhérence des cellules. Transférez l’échafaudage partiellement séché dans un puits frais. Semez une goutte de suspension MSC sur l’échafaudage.

De plus, ajoutez plus de média dans les coins du puits pour créer une chambre d’hydratation qui empêche l’évaporation du média de la goutte lors de l’incubation ultérieure. Incuber pour permettre aux CSM d’adhérer à la surface de l’échafaudage. Retournez l’échafaudage pour exposer la surface non ensemencée. Pipetez une goutte fraîche de suspension MSC de ce côté et laissez les MSC adhérer.

Une fois que les CSM ont adhéré aux deux côtés de l’échafaudage, couvrez-le avec plus de milieu en vous assurant que toutes les cellules sont en contact avec le média. Incuber jusqu’à ce que les CSM se développent et s’infiltrent dans les interstices et les pores de l’échafaudage. L’échafaudage ensemencé MSC est prêt pour l’implantation chirurgicale.

Préparez les échafaudages 48 heures avant l’implantation chez la souris en coupant d’abord les échafaudages en PLA en morceaux de la taille d’une cavité de résection d’environ 2 x 2 millimètres. Stérilisez les échafaudages en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 15 minutes. Après 15 minutes, plongez les échafaudages dans du PBS. Ensuite, placez les échafaudages dans le milieu d’aigle modifié de Dulbecco contenant 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine tout en préparant les cellules pour l’ensemencement.

Pour préparer les cellules, soulevez d’abord les CSM cultivées à l’aide de 0,05 % de trypsine. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Après l’incubation, assurez-vous que les cellules se sont soulevées. Ensuite, ajoutez du DMEM dans la fiole pour inactiver la trypsine. Ensuite, transférez le contenu du ballon dans un tube à centrifuger de 15 millilitres. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ensuite, granulez 5 fois 10 à la cinquième MSC pour chaque échafaudage par centrifugation à 100 x g pendant 5 minutes.

Après la centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension les CSM dans 5 microlitres de DMEM par 5 fois 10 jusqu’aux cinquièmes cellules. Ensuite, retirez un échafaudage de l’immersion DMEM à l’aide d’une pince et placez-le sur le couvercle de la plaque à 6 puits. Soulevez l’échafaudage du couvercle, laissant derrière vous une gouttelette de DMEM en excès. Remettez l’échafaudage sur le couvercle dans un nouvel endroit sec. Répétez l’opération trois à cinq fois. Ensuite, placez l’échafaudage partiellement séché dans une nouvelle plaque à 6 puits pour l’ensemencement.

Un échafaudage partiellement séché permet d’obtenir des résultats optimaux d’ensemencement cellulaire. Si l’échafaudage est trop humide, les cellules glisseront de l’échafaudage et adhéreront à la plaque située en dessous. Si l’échafaudage doit sécher, les gouttelettes ne se répandront pas sur l’ensemble de l’échafaudage, ce qui entraînera une mauvaise distribution initiale des cellules.

À l’aide d’une pipette, mélangez délicatement le tube de CSM pour homogénéiser la suspension car certaines cellules peuvent s’être déposées au fond. Pipetez lentement 2,5 microlitres de suspension MSC fraîchement mélangée directement sur l’échafaudage, en créant une petite gouttelette sur le dessus de l’échafaudage. Ajoutez 300 microlitres de DMEM sur les bords de chaque puits pour éviter l’évaporation rapide des gouttelettes cellulaires. Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en laissant les cellules se fixer à l’échafaudage.

Après l’incubation, à l’aide d’une pince, retournez doucement les échafaudages dans la plaque du puits. Grainez 2,5 microlitres de suspension MSC fraîchement mélangée pour obtenir un total de 5 fois 10 à la cinquième cellules ensemencées par échafaudage. Après une incubation de 30 minutes pour permettre aux cellules de se fixer à l’échafaudage, recouvrez les échafaudages de DMEM en ajoutant 2 millilitres dans chaque puits de la plaque à 6 puits. Soulevez doucement les échafaudages pour permettre aux fluides de s’écouler en dessous. Incuber à 37 degrés Celsius dans cet état pendant 48 heures avant la chirurgie d’implantation.