Marquage fluorescent des cellules de gliome : une méthode de transfection basée sur un vecteur lentiviral pour obtenir des cellules de gliome exprimant une protéine fluorescente pour l’imagerie des tissus profonds

L’imagerie in vivo du cancer du cerveau consiste à injecter des cellules cancéreuses marquées par fluorescence dans le cerveau de la souris pour observer le développement de la tumeur. Pour le marquage fluorescent, incubez des cellules de gliome avec des particules de lentivirus. Le vecteur lentiviral porte le gène de la protéine fluorescente infrarouge, iRFP.

Le virus se lie à la surface de la cellule du gliome et libère de l’ARN dans la cellule. Les enzymes cellulaires convertissent l’ARN viral en ADN double brin, qui s’intègre dans le génome cellulaire et permet l’expression de l’iRFP. Les maxima d’excitation et d’émission de l’iRFP se situent dans une région proche infrarouge où les tissus ont une absorbance et une diffusion minimales. Cela permet une imagerie précise des tissus profonds.

Ensuite, retirez le milieu épuisé et ajoutez de la trypsine. La trypsine, une enzyme protéase, digère les protéines d’adhésion, détachant les cellules de la surface du ballon. Pipeter à plusieurs reprises pour séparer les cellules individuelles. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube et centrifuger. Maintenant, ajoutez un tampon approprié pour remettre le granulé en suspension.

Distribuez la suspension cellulaire dans des tubes de cytométrie en flux et colorez les cellules avec un colorant fluorescent, DAPI. Le DAPI colore le noyau des cellules mortes en bleu vif, les distinguant des cellules vivantes. À l’aide d’un trieur de cellules activé par fluorescence ou FACS, triez les cellules vivantes positives à l’iRFP des autres populations cellulaires en fonction de leur fluorescence. Les cellules isolées peuvent être utilisées pour l’injection chez la souris pour l’imagerie tumorale.

Commencez par ensemencer 1 fois 10 à la sixième cellules de glioblastome dans 5 millilitres de milieu dans une boîte de 10 centimètres pour une incubation de 24 heures dans un incubateur de culture cellulaire. Le lendemain matin, transduisez les cellules avec le lentivirus exprimant une protéine fluorescente appropriée d’intérêt à une multiplicité d’infection de 5 et retournez les cellules dans l’incubateur.

Après 24 heures, remplacez le surnageant par 5 millilitres de milieu frais et incubez la culture pendant 48 heures supplémentaires. À la fin de l’incubation, remplacez le milieu par 3 à 5 millilitres de trypsine pendant 10 à 15 minutes à 37 degrés Celsius, suivi d’un pipetage minutieux pour dissocier complètement les cellules détachées.

Collecter les cellules par centrifugation et remettre en suspension le granulé dans 500 microlitres de solution de tri. Divisez les cellules en un nombre approprié de tubes FACS et fixez les cellules avec du DAPI pour l’exclusion des cellules mortes. Ensuite, chargez les tubes sur le cytomètre en flux et triez les cellules vivantes en fonction de leur expression fluorescente dans un tube conique de 15 millilitres contenant une solution de tri fraîche.

Après la centrifugation, réintroduisez les cellules constructives positives/DAPI négatives dans 5 millilitres de milieu de culture et ensemencez-les dans une nouvelle boîte de 10 centimètres pour leur culture à 37 degrés Celsius pendant 48 à 72 heures. À la fin de l’incubation, divisez les cellules pour l’ensemencement dans plusieurs boîtes pour des expériences in vivo ultérieures.