Encyclopédie des expériences JoVE
Recherche sur le cancer
0 vues • 4:15 min • July 8th, 2025
Les cellules souches de tumeurs cérébrales ou BTSC, une sous-population de cellules tumorales cérébrales, peuvent initier la croissance tumorale et les métastases, ce qui en fait des cibles prometteuses pour le traitement du cancer. Pour étudier l’effet des médicaments sur la migration des BTSC in vitro, il faut d’abord préparer des suspensions uniformes de BTSC dans un milieu approprié. Traitez l’une des suspensions avec le médicament d’intérêt.
Pendant ce temps, procurez-vous une plaque de chimiotaxie multi-puits composée d’inserts membraneux qui séparent chaque puits en chambres supérieure et inférieure. La pipette désirait les protéines de la matrice extracellulaire vers les chambres inférieures et les inserts membraneux. Incuber pour faciliter la polymérisation de la protéine.
Ajouter un milieu basal approprié contenant le chimioattractant souhaité dans les chambres inférieures et le placer sur les inserts membraneux. Ensuite, ensemencez la suspension de BTSC traitée et non traitée par le médicament dans des inserts membraneux. Imagez la plaque pendant une durée prolongée à l’aide de la microscopie à cellules vivantes.
En culture, les BTSC adhèrent à la matrice protéique de l’insert. En réponse au gradient de concentration de chimioattractant établi entre les chambres supérieure et inférieure, les BTSC non traités migrent à travers la matrice protéique à travers les pores de l’insert membranaire jusqu’à la chambre inférieure.
Cependant, le traitement médicamenteux affecte négativement l’activité fonctionnelle des cellules, diminuant la migration des BTSC. Maintenant, à l’aide d’un logiciel approprié, analysez et quantifiez les BTSC migrés dans les chambres inférieures. Les BTSC non traités présentent une migration accrue, tandis que les BTSC traités par des médicaments montrent une migration réduite.
Pour évaluer les effets d’un traitement médicamenteux d’intérêt sur la migration, il faut d’abord prétraiter les cellules avec la concentration appropriée du médicament pendant une période expérimentale appropriée. Pour préparer la plaque de chimiotaxie, enduire trois puits d’insertion à membrane et trois puits de réservoir inférieur par condition d’une plaque de chimiotaxie de 96 puits avec 75 et 225 microlitres de 0,2 milligramme par millilitre de collagène de type I, respectivement, pendant 1 heure à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, aspirez la solution de collagène de chaque puits sans rayer l’enrobage de collagène et lavez les puits deux fois avec du PBS stérile. Après le dernier lavage, retirez l’insert de la plaque et ajoutez 225 microlitres de milieu sans facteur de croissance complété par 10 % de FBS dans chaque puits de réservoir inférieur de la plaque de chimiotaxie.
Ensuite, remettez doucement l’insert supérieur dans le réservoir inférieur en biais pour éviter de créer des bulles et ajoutez 2,5 fois 10 au tiers des BTSC dissociés dans 50 microlitres de milieu sans facteur de croissance dans chaque puits d’insertion. Il est important de dissocier complètement les BTSC en cellules uniques et de les compter soigneusement avant le placage pour éviter d’avoir des amas de cellules ou trop de cellules dans l’insert supérieur.
Pour imager la migration BTSC le long du gradient FBS, placez la plaque dans un système d’imagerie de cellules vivantes et configurez le logiciel d’imagerie automatisé pour acquérir des images microscopiques de la plaque toutes les 1 à 2 heures pendant un maximum de 72 heures. Une fois l’acquisition de l’image terminée, sélectionnez une nouvelle définition de traitement pour distinguer les BTSC de leurs pores d’insertion sur la face inférieure de la membrane, en modifiant l’analyse si elle ne distingue pas avec précision les cellules de la membrane d’arrière-plan si nécessaire.
Pour quantifier les cellules qui ont migré à travers les pores, collectez les données sous forme de surface cellulaire sur la face inférieure de la membrane pour chacun des trois puits de réplication par condition. Ensuite, représentez graphiquement la migration cellulaire au fur et à mesure que l’aire des cellules a migré en micromètres carrés au fil du temps.