Isolement et culture de péricytes cérébraux primaires : procédure d’isolement et de culture de péricytes à partir de capillaires cérébraux bovins sans contamination des cellules endothéliales

0 vues4:21 min • July 8th, 2025

Dans le système nerveux central, les péricytes sont des cellules multifonctionnelles qui enveloppent les cellules endothéliales, qui forment la paroi cellulaire interne des capillaires. Les péricytes aident à réguler le flux sanguin et à maintenir l’homéostasie cérébrale.

Pour isoler les péricytes, commencez par prélever des capillaires de cerveau de bovin congelés dans un flacon. Après la décongélation, transférez le contenu dans un tube contenant le fluide souhaité. Centrifugeuse pour granuler les capillaires. Retirez le surnageant contenant du fluide de congélation. Remettez la pastille capillaire en suspension dans un milieu et ensemencez la suspension dans une fiole enrobée de protéines de matrice extracellulaire.

Incuber pour permettre aux capillaires d’adhérer à l’enrobage dans le ballon. Remplacez le support par un support contenant de l’héparine. En culture, l’enrobage protéique de la matrice extracellulaire favorise la migration des péricytes loin des fragments capillaires et la prolifération, tandis que l’héparine stimule la migration des cellules endothéliales.

Remplacez le support usagé par un support contenant de l’héparine. Au fil du temps, les péricytes projettent des processus allongés qui adhèrent fortement au ballon. Avec un espace de substrat limité, les cellules endothéliales prolifèrent et forment une monocouche inhibée par contact. Une fois que la densité de péricytes est appropriée, prélever le milieu et laver le ballon avec un tampon.

Utilisez la trypsine-EDTA pour détacher les cellules endothéliales faiblement liées du flacon. Par la suite, ajoutez un milieu pour neutraliser l’activité trypsine-EDTA. Laver avec un média à plusieurs reprises pour éliminer les cellules endothéliales détachées. Ajouter le milieu et s’assurer que les péricytes restent attachés au ballon. Incuber la culture enrichie en péricytes pour qu’elle prolifère.

Commencez par décongeler une fiole de capillaires dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Une fois les capillaires décongelés, transférez-les dans un tube à centrifuger avec 30 millilitres de DMEM-comp et centrifugez-les pendant 5 minutes à 500 x g. Ensuite, retirez le fluide du tube et remettez le granulé en suspension dans 10 millilitres de DMEM-comp frais. Transférez la suspension dans une fiole T75 enduite et laissez les capillaires adhérer au fond pendant 4 à 6 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius alimenté à 10 % de dioxyde de carbone. Après l’incubation, inspectez le ballon au microscope optique.

Les fractions de capillaires doivent maintenant être fixées au fond du flacon. Le jour 4, après l’ensemencement des capillaires, inspectez-les au microscope pour vous assurer qu’ils sont confluents à environ 60 % à 70 %. Aspirez le milieu et lavez délicatement les cellules avec du PBS. Ajouter 2 millilitres de trypsine-EDTA décongelée et laisser le ballon dans l’incubateur pendant 1 à 3 minutes, en retirant fréquemment le ballon et en observant le détachement cellulaire au microscope. Lorsque les cellules endothéliales commencent à s’arrondir, tapotez doucement le ballon pour les détacher.

Lorsque les cellules se sont détachées, arrêtez la trypsinisation en ajoutant 10 millilitres de DMEM-comp dans le flacon. Rincer le ballon plusieurs fois avec le fluide et aspirer la suspension de cellules endothéliales, qui peut maintenant être utilisée à d’autres fins. Ajoutez 10 millilitres de DMEM-comp dans le flacon et vérifiez-le au microscope optique pour vous assurer que les péricytes sont toujours présents et attachés au fond. Ensuite, remettez le flacon dans l’incubateur pour permettre à la culture enrichie en péricytes de se développer.

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Dernière mise à jour : 29 août 2026