Isolement des capillaires cérébraux du cerveau humain : une méthode optimisée pour extraire les capillaires cérébraux du tissu cérébral humain

Les capillaires cérébraux sont un composant essentiel de la barrière hémato-encéphalique - une barrière semi-perméable qui permet un mouvement sélectif des solutés entre le sang et le cerveau. Pour isoler les capillaires cérébraux, commencez par du tissu cérébral humain frais. Retirez les méninges et coupez la matière blanche.

Coupez le tissu cérébral en fragments plus petits. Transférez les fragments dans un homogénéisateur contenant un tampon approprié et homogénéisez. L’homogénéisation désintègre les tissus, libérant des capillaires et des débris tissulaires dans la solution.

Transférez l’homogénat dans un tube frais et ajoutez un volume optimal d’un milieu à gradient de densité approprié. Centrifuger la solution pour granuler les capillaires. Un gradient de densité trop important ou trop faible entraîne un faible rendement capillaire. Retirez le surnageant.

Remettre le granule en suspension dans du sérum de bovin, de l’albumine ou un tampon supplémenté en BSA. La BSA stabilise les enzymes digestives et maintient l’intégrité structurelle des capillaires. Ensuite, filtrez la solution avec un filtre approprié pour éliminer les gros vaisseaux et les débris tissulaires.

Ensuite, faites passer le filtrat à travers un filtre à mailles plus petites. Ce filtre retient les capillaires cérébraux et permet le passage des petits débris et des globules rouges. Ensuite, retournez le filtre et lavez les capillaires dans un tube frais avec un tampon supplémenté en BSA.

Centrifugez la solution et retirez le surnageant. Remettez en suspension les capillaires purs dans le tampon et stockez-les pour une utilisation ultérieure.

Pour commencer cette procédure, documentez le poids du tissu cérébral humain, qui doit être d’environ 10 grammes. Au microscope, retirez soigneusement toutes les méninges à l’aide d’une pince et utilisez un scalpel pour couper la substance blanche. Ensuite, découpez soigneusement le tissu cérébral et hachez-le avec un scalpel pendant environ 5 minutes.

Transférez le tissu cérébral dans le broyeur de tissus et ajoutez 30 millilitres de tampon d’isolement. Par la suite, homogénéisez chaque échantillon avec 100 coups à 50 tr/min. Ne remuez pas l’air pour éviter les bulles. Documentez le temps tous les 25 coups et le temps total nécessaire pour 100 coups. Ensuite, transférez l’homogénat dans un homogénéisateur Dounce sur glace. Homogénéiser la suspension pendant environ 20 coups et éviter les bulles.

Ensuite, répartissez l’homogénat cérébral de manière égale dans quatre tubes de centrifugation de 50 millilitres et documentez le volume total de l’homogénat. Assurez-vous d’ajouter le bon volume de Ficoll. Trop peu ou trop de Ficoll entraînera une densité incorrecte pour séparer les capillaires des débris cellulaires et réduira ainsi la pastille capillaire et limitera le rendement.

Utilisez 10 millilitres de tampon d’isolement pour rincer le pilon et l’homogénéisateur et répartissez-le dans les quatre tubes de centrifugation. Ensuite, distribuez 50 millilitres de tampon de gradient de densité dans les tubes de centrifugation. Fermez hermétiquement les tubes de centrifugation avec des bouchons. Ensuite, mélangez l’homogénat, le milieu à gradient de densité et le tampon en secouant vigoureusement les tubes. Centrifugeuse à 5 800 x g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Par la suite, jetez le surnageant et remettez en suspension chaque pastille dans 2 millilitres de BSA à 1 %.

Après avoir remis le granulé en suspension, filtrez la suspension à travers la maille de 300 micromètres. Les capillaires sont filtrés à travers le maillage, tandis que les vaisseaux plus gros et les débris cérébraux plus gros restent sur le treillis. Lavez soigneusement le treillis avec jusqu’à 50 millilitres de BSA à 1 %, puis jetez le treillis. Pour séparer les capillaires des globules rouges et autres débris cérébraux, répartissez le filtrat capillaire sur des filtres à cellules de 530 micromètres.

Les capillaires sont retenus par ce filtre, tandis que les globules rouges, les autres cellules uniques et les petits débris cérébraux passent à travers le filtre et sont collectés dans le filtrat. Ensuite, lavez chaque filtre avec 25 millilitres de BSA à 1 %. Versez tous les filtrats sur le sixième filtre pour augmenter le rendement. Lavez chaque filtre avec 50 millilitres de BSA à 1 %. Conservez les filtres de déformation cellulaire contenant les capillaires et jetez le filtrat. Ensuite, retournez les filtres et lavez les capillaires avec 50 millilitres de BSA à 1 % dans des tubes de 50 millilitres.

Appliquez doucement une pression avec la pointe de la pipette et déplacez-la sur le filtre pour éliminer les capillaires cérébraux. Assurez-vous de laver tous les capillaires cérébraux, en particulier du bord du filtre. Évitez les bulles, car cela rend le processus de filtration plus difficile et augmente le risque de perte capillaire. Après avoir collecté les capillaires, centrifugez tous les échantillons à 1 500 x g pendant 3 minutes à 4 degrés Celsius. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans environ 3 millilitres de tampon d’isolement.

Ensuite, combinez toutes les pastilles remises en suspension d’un échantillon dans un tube conique de 15 millilitres et remplissez-le d’un tampon d’isolement. Centrifugez à nouveau à 1 500 x g pendant 3 minutes à 4 degrés Celsius et lavez deux fois de plus. Documentez la pureté capillaire avec un microscope à un grossissement de 100X et une caméra. Les capillaires cérébraux isolés peuvent maintenant être utilisés pour des expériences, traités ou congelés, et stockés à moins 80 degrés Celsius dans des cryotubes pendant au moins 6 à 12 mois.