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La zymographie est une technique électrophorétique qui implique un substrat protéique copolymérisé avec un gel de polyacrylamide pour détecter les enzymes hydrolytiques et leur activité. Pour commencer, dissolvez les échantillons dans un tampon de zymographie contenant du glycérol, du dodécylsulfate de sodium ou SDS et du bleu de bromophénol.
Le glycérol rend le tampon d’échantillon plus dense que le tampon de courant environnant du gel, ce qui permet un chargement facile dans les poches de gel. Le SDS - un détergent anionique - dénature les enzymes de l’échantillon et les enrobe d’une charge négative. Le bleu de bromophénol - un colorant de suivi - aide à surveiller la progression de l’échantillon dans le gel.
Chargez les échantillons dans un gel de polyacrylamide enrobé de substrats fluorogéniques pour détecter l’activité de la protéase. Maintenant, connectez les électrodes et commencez l’électrophorèse. Le champ électrique généré fait migrer toutes les enzymes liées au SDS à travers le gel vers l’électrode chargée positivement.
Une fois l’électrophorèse terminée, retirez le gel et lavez-le dans un tampon renaturant contenant un détergent non ionique qui déplace le SDS pour permettre la renaturation de l’enzyme. Ensuite, incubez le gel dans un tampon en développement contenant des cations divalents qui activent les enzymes du gel.
Les protéases actives clivent les substrats fluorogènes, provoquant une augmentation de la fluorescence. Imagez le gel pour observer les bandes de protéines fluorescentes dont l’intensité est proportionnelle à l’activité de la protéase.
Pour commencer, dissolvez les échantillons dans un tampon d’échantillon de zymographie conventionnel. Ajoutez 400 millilitres de 1x tampon de course Tris-Glycine SDS à l’appareil de gel. Chargez jusqu’à 35 microlitres d’échantillon par puits. Analysez les échantillons à 120 volts à 4 degrés Celsius pendant 1,5 heure ou jusqu’à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt se trouvent dans la couche de gel de résolution peptidique. Après cela, retirez les gels de la cassette en plastique.
Lavez les gels trois fois dans un tampon renaturant à température ambiante sous une légère agitation, chaque lavage durant 10 minutes. Transférer les gels dans une solution tampon en développement pendant 15 minutes. Ensuite, remplacez la solution par un tampon en développement frais et incubez à 37 degrés Celsius sous une légère agitation pendant 24 heures. Ensuite, utilisez un scanner/imageur à gel fluorescent avec les filtres d’excitation et d’émission appropriés pour imager les gels.