Livraison de gènes basée sur l’électroporation in utero : une technique pour injecter de l’ADN plasmidique dans des cellules cérébelleuses embryonnaires d’embryons murins

Commencez par prendre un modèle de souris femelle enceinte anesthésiée placé en position couchée. Préparez la souris en enlevant les poils de la région abdominale. Inciser la peau et les couches musculaires sous-jacentes pour exposer les cornes utérines - les sites qui hébergent des embryons viables.

Maintenant, retirez les cornes utérines de la cavité abdominale. Prenez un capillaire de verre à pointe pointue contenant la solution d’ADN plasmidique souhaitée. Localisez le cerveau de l’embryon et injectez la solution d’ADN plasmidique à travers la paroi de l’utérus dans le quatrième ventricule. Cette position est antérieure au primordium cérébelleux - l’endroit souhaité pour l’administration éventuelle de l’ADN.

Après l’injection, rétractez le capillaire vide. Ensuite, pour l’électroporation de l’embryon injecté d’ADN, positionnez les deux électrodes sur la paroi utérine de sorte que l’électrode positive recouvre le primordium cérébelleux et que l’électrode négative couvre la région autour des oreilles.

Appliquez des impulsions électriques pendant la durée souhaitée. Ces impulsions rendent les cellules neuronales cérébelleuses perméables, ce qui permet à l’ADN plasmidique de pénétrer dans les cellules ciblées. Enfin, replacez les cornes utérines à l’intérieur de la cavité abdominale à leur position naturelle. Suturez les coupures, transférez la souris dans sa cage et laissez-la récupérer.

Commencez par charger un capillaire en verre borosilicaté dans un extracteur de micropipette et tirez pour créer une pointe fine. Étiquetez l’embout capillaire avec de l’encre noire pour une meilleure visualisation lors de l’injection et dessinez un détartrage sur le verre. En travaillant sous un stéréomicroscope, utilisez une règle et une pince à épiler à aiguille pointue pour couper la pointe à une longueur d’environ 6 millimètres et créer un bord biseauté tranchant et unilatéral.

Filtrez une solution mère Fast Green à 1 % à travers un filtre de 0,22 micron pour éliminer les particules de colorant de la solution. Mélangez les plasmides d’ARN à guide unique à parts égales avec le plasmide rapporteur de la luciférase jusqu’à une concentration finale d’au moins 1 microgramme par millilitre pour chaque plasmide.

Colorer la solution plasmatique avec Fast Green à une concentration finale de 0,05 %. Après avoir anesthésié une souris CD-1 enceinte avec de l’isoflurane, placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant et administrez un analgésique. Appliquez une pommade pour les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire pendant la chirurgie. Fixez les membres avec du ruban adhésif et stérilisez l’abdomen avec un désinfectant.

Couvrez la souris avec de la gaze, en ne laissant que la zone chirurgicale exposée. Après avoir fait une incision cutanée d’environ 2 centimètres de longueur, localisez la linea alba et utilisez des ciseaux à tissu à pointe émoussée pour faire une deuxième incision légèrement plus petite à travers le péritoine. Humidifiez la cavité abdominale ouverte avec du PBS stérile préchauffé.

Ensuite, utilisez une pince à anneau pour extraire soigneusement les cornes utérines de la cavité abdominale. Saisissez la paroi utérine au niveau de l’espace entre les sacs vitellins de deux embryons voisins et tirez doucement. Évitez toute pression sur l’embryon tout en le tirant à travers l’incision. Une fois les cornes utérines extraites, aspirez environ 10 à 15 microlitres de solution plasmidique colorée avec le capillaire de verre préparé. Évitez les bulles d’air pendant ce processus.

Tenez doucement l’embryon à l’aide d’une pince à anneau et localisez la zone du cou. Pénétrer lentement le cerveau postérieur dorsal avec l’extrémité du capillaire de verre et se déplacer dans le quatrième ventricule. Injectez environ 1 microlitre du mélange plasmidique. Confirmez que l’ADN teint n’a pas fui du cerveau et qu’il est visible sous la forme d’une structure en forme de diamant.

Ici, il est très important de remplir toute la région du quatrième ventricule avec une solution plasmidique pour délivrer de l’ADN également à la partie distale du primordium cérébelleux. Dans le même temps, assurez-vous de ne pas provoquer de saignement pendant ce processus.

Placez une pince à épiler en platine équipée de plaques d’électrodes de 5 millimètres de diamètre latéralement sur la tête de l’embryon avec le pôle négatif couvrant l’oreille et le pôle positif positionné au niveau du primordium cérébelleux sur la paroi utérine et appliquez des impulsions électriques carrées.

Lorsque tous les embryons ont été électroporés, replacez soigneusement les cornes utérines dans la cavité abdominale et remplissez-les de PBS stérile. Laissez la corne utérine glisser dans une position naturelle. Éteignez l’anesthésie et placez l’animal sur le ventre dans une nouvelle cage pour récupérer.