Électroporation ex vivo de tranches cérébelleuses d’embryons de poulet : une méthode d’introduction d’ADN plasmidique codant pour une protéine fluorescente verte pour visualiser le développement cellulaire granulaire

Les

cellules granulaires cérébelleuses sont le type de neurones le plus abondant du cerveau. La couche granulaire externe, EGL, est composée uniquement de précurseurs de cellules granulaires, GCP, qui se différencient et migrent vers l’intérieur pour former la couche granulaire interne, IGL.

Pour visualiser le développement de cellules granulaires, préparez une chambre d’électroporation en fixant une anode à la base d’une boîte de Pétri. Ajouter un milieu de culture pour couvrir l’électrode. Maintenant, placez un insert de culture sur l’électrode recouverte de moyen. Transférez les tranches de cervelet de l’embryon de poulet sur l’insert de culture dans une orientation sagittale.

Le plan sagittal permet d’identifier la couche cible-EGL contre différentes couches du cervelet. Ajouter une solution de colorant visqueux contenant un ADN plasmidique GFP sur EGL. L’ADN plasmidique GFP code pour une protéine fluorescente verte qui se distribue de manière homogène dans le cytoplasme cellulaire et permet l’imagerie de cellules vivantes.

Ensuite, placez une cathode dans le milieu près de l’EGL mais pas directement sur le tissu. Ensuite, appliquez plusieurs impulsions électriques à différentes régions EGL. Les impulsions électriques induisent des pores temporaires dans la membrane cellulaire, permettant aux cellules d’absorber l’ADN plasmidique. Par la suite, l’ADN plasmidique permet l’expression de la GFP dans les cellules granulaires.

Imagez les coupes cérébelleuses au microscope à fluorescence pour observer la différenciation cellulaire granulaire et le modèle de migration à travers les différentes étapes du développement cellulaire.

Construisez une chambre d’électroporation en fixant l’anode d’un électroporateur à la base d’une boîte de Pétri de 60 millimètres à l’aide d’un ruban isolant. Ajoutez environ 1 millilitre de HBSS pour couvrir l’électrode. Ensuite, placez un insert de culture de 0,4 micromètre sur l’électrode recouverte de HBSS.

À l’aide d’une pipette Pasteur de 3 millilitres munie d’une pointe coupée, transférez les tranches identifiées, jusqu’à 5 par insert, sur l’insert de culture. Ensuite, séparez les tranches et laissez-les se déposer sur l’insert de culture dans une orientation sagittale. À l’aide d’une pipette, retirez l’excès de milieu des tranches de cerveau. Laissez l’insert reposer sur l’électrode afin qu’il y ait un contact entre l’insert et l’électrode.

Dans cette configuration, l’insert de culture avec les tranches reposera sur la surface du milieu, maintenant le circuit mais permettant un ciblage spatial de la cathode. À l’aide d’une pointe de pipette P10, pipetez 5 microlitres d’ADN dilué avec 20 % de Fast Green sur la surface d’une région ciblée de chaque tranche. L’ajout de Fast Green garantit que la solution d’ADN est suffisamment visqueuse pour empêcher une large dispersion de l’ADN.

Ensuite, placez la cathode sur le tissu ciblé souhaité et électroporatez les échantillons. Évitez le contact direct de la cathode avec le tissu en plaçant la cathode aussi près que possible du tissu sans le toucher. Répétez l’électroporation dans plusieurs régions de la couche granulaire externe sur chaque tranche cérébelleuse individuelle si vous le souhaitez.

Lorsque vous avez terminé, transférez l’insert de culture dans une boîte de Pétri de 30 millimètres. À chaque culture, ajoutez 1 millilitre de milieu de culture préchauffé sous l’insert de culture. Assurez-vous que l’insert ne flotte pas sur le support. L’insert de culture doit être en contact avec le milieu, mais les tranches ne doivent pas y baigner.