Électroporation de cellules uniques dans des cultures de tranches de cerveau organotypiques : une technique in vitro pour délivrer des plasmides à l’intérieur de neurones ciblés dans des coupes d’hippocampe cérébral

Commencer l’électroporation en prenant une pipette en verre contenant la solution plasmidique souhaitée. Fixez-le à un porte-micropipette équipé d’une électrode en fil d’argent, en veillant à ce que l’électrode soit insérée dans la micropipette. Prenez une chambre d’électroporation contenant une section d’hippocampe ultramince immergée dans du liquide céphalo-rachidien artificiel.

Trempez l’électrode de terre dans le fluide présent dans la chambre pour l’électroporation ultérieure. Abaissez la pointe de la pipette dans la chambre d’électroporation et enregistrez la résistance de base. À l’aide d’un microscope, positionnez la pointe de la pipette près de la cellule cible. Une fois que la pipette est en contact avec la membrane neuronale, sa résistance augmente fortement.

Appliquez une pression d’air positive pour créer une petite invagination dans la membrane neuronale. Appliquez rapidement une légère aspiration pour pousser la membrane vers le haut, créant ainsi un joint lâche entre la pointe de la pipette et la membrane. Répétez ce processus quelques fois de plus pour conditionner la membrane et éviter la lyse cellulaire.

Après le conditionnement, appliquez une forte aspiration pour former un joint étanche avec une membrane appelée joint gigaohm. Utilisez des impulsions électriques pour former des pores transitoires dans la zone scellée de la membrane. Ces ouvertures facilitent l’entrée des plasmides à l’intérieur du neurone ciblé. Après l’électroporation, les pores se referment, piégeant les plasmides à l’intérieur du neurone.

Pour préparer les cultures en tranches pour l’électroporation, transférez les inserts de culture d’intérêt dans des boîtes de Pétri individuelles de 3 centimètres chargées de 900 microlitres de milieu de culture et placez les cultures dans un incubateur de dioxyde de carbone de table. Ensuite, pré-incubez des inserts de culture fraîche avec 1 millilitre de milieu de culture en tranches par insert dans une boîte de Pétri de 3,5 centimètres pendant au moins 30 minutes, et stérilisez les lignes du rig d’électroporation avec 10 % d’eau de Javel pendant 5 minutes.

À la fin de la perfusion, rincer les conduites avec de l’eau ionisée autoclavée pendant au moins 30 minutes avant de les perfuser avec de l’aCSF stérilisé par filtre contenant 0,001 millimolaire de tétrodotoxine. Réglez l’impulsion de l’électroporateur sur une amplitude de moins 5 volts, une impulsion carrée, un train de 500 millisecondes, une fréquence de 50 Hertz et une largeur d’impulsion de 500 microsecondes. Remplissez une pipette en verre avec 5 microlitres de solution interne contenant un plasmide et effleurez doucement et tapotez l’embout plusieurs fois pour éliminer les bulles piégées.

Utilisez un microscope de dissection pour confirmer que la pointe n’est pas endommagée et fixez solidement la pointe de la pipette à l’électrode. Lorsque la pointe entre en contact avec l’aCSF, notez la lecture de la résistance de la pipette de l’électroporateur. Pour isoler une culture en tranches, coupez la membrane de l’insert de culture à l’aide d’une lame tranchante et à l’aide d’une pince à angle vif pour transférer soigneusement la culture en tranches dans la chambre d’électroporation. Ensuite, fixez la position de culture avec une ancre de tranche.

Pour l’électroporation des cellules d’intérêt, appliquez une pression positive sur la pipette à la bouche et utilisez les commandes tridimensionnelles du bouton pour manœuvrer la pointe de la pipette près de la surface de la culture de tranches. En observant la culture au microscope, approchez-vous de la cellule cible avec la pointe, en maintenant la pression positive appliquée jusqu’à ce qu’une fossette se forme à la surface de la cellule. Une fois la fossette visualisée, appliquez rapidement une légère pression négative par la bouche afin qu’un joint lâche se forme entre la pointe de la pipette et la membrane plasmique.

La membrane entrera légèrement dans la pipette. Une augmentation d’environ 2,5 fois de la résistance initiale de la pipette doit être observée, comme l’indique une augmentation de la tonalité des haut-parleurs. Réappliquez rapidement une pression positive pour que la fossette se reforme. Ensuite, effectuez immédiatement au moins deux autres cycles de pression, comme nous venons de le démontrer, sans faire de pause. Après la dernière impulsion de pression, maintenez la pression négative pendant 1 seconde. Le son des haut-parleurs atteint un sommet stable en hauteur. Utilisez la pédale pour pulser rapidement l’électroporateur.

Après l’électroporation, rétractez doucement la pipette à environ 100 microns de la cellule sans appliquer de pression et réappliquez une pression positive, en vérifiant que la résistance est similaire à la lecture de base avant d’approcher de la cellule suivante. Lorsque toutes les cellules d’intérêt ont été électroporées, transférez la culture en tranches dans l’un des inserts de culture fraîche préparés et placez l’insert à 35 degrés Celsius pendant 3 jours maximum.