Isolement des neurones de la moelle épinière : une procédure de gradient de densité pour isoler les neurones de la moelle épinière néonatale pour les études in vitro

Pour isoler les neurones de la moelle épinière, prenez une colonne vertébrale d’une souris néonatale et placez-la sur une boîte de Pétri. Rincer la colonne vertébrale avec un tampon salin pour libérer la moelle épinière. Transférez la moelle épinière dans un milieu neuronal froid pour favoriser la survie cellulaire.

Ensuite, hachez la moelle épinière et transférez les fragments dans un tube contenant un milieu neuronal frais. Incuber le tube dans un bain-marie pour l’acclimatation. Après l’incubation, retirez le milieu épuisé et ajoutez le milieu de digestion. Les enzymes digestives clivent la matrice tissulaire pour desserrer les cellules.

Effectuez la trituration en aspirant les fragments de tissu dans la pipette et videz rapidement les composants, libérant les cellules individuelles en suspension. Ensuite, transférez cette suspension dans un tube contenant un milieu à gradient de densité et centrifugez.

Après la centrifugation, la couche superficielle du tube contient des débris tissulaires. La première couche comprend des oligodendrocytes et des astrocytes. Les deuxième et troisième couches comprennent des neurones, la troisième couche ayant la pureté la plus élevée. Enfin, la pastille contient des cellules microgliales.

Collectez la troisième couche dans un tube frais et ajoutez un milieu neuronal pour diluer le milieu à gradient de densité. Centrifugeuse pour granuler les neurones. Jetez le surnageant et remettez la pastille en suspension dans un milieu neurobasal afin de préserver les neurones pour d’autres expériences.

Pour commencer cette procédure, séparez la tête du corps des bébés souris euthanasiés à l’aide de ciseaux. Ensuite, stabilisez la queue et les bras sur la table d’intervention avec le côté dorsal vers le haut. Ensuite, coupez la peau à l’aide des ciseaux à iris incurvés. Après cela, coupez la moelle épinière de la région lombaire juste au-dessus des hanches, puis coupez les deux côtés du thorax pour le séparer du corps.

Lavez les échantillons séquentiellement dans trois boîtes de Pétri de 10 centimètres contenant 5 millilitres de PBS stérilisé pendant 10 secondes chacune pour éliminer l’excès de tissu. Par la suite, insérez une aiguille et une seringue de calibre 22 remplies de 5 millilitres de PBS stérilisé dans l’extrémité caudale de la colonne vertébrale et rincez le crâne, permettant au cordon de sortir dans une quatrième boîte de Pétri

Transférez la moelle épinière dans un tube de 15 millilitres avec 5 millilitres de HABG sur de la glace. Évitez d’écraser la moelle épinière et répétez les procédures pour le reste des chiots. Idéalement, ce processus ne devrait pas prendre plus de 30 minutes pour un groupe de chiots afin d’assurer une isolation neuronale saine.

Pour préparer le gradient de densité, préparez chacune des quatre couches dans quatre tubes de 15 millilitres. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de chaque couche dans un nouveau tube de 15 millilitres. Commencez par la couche 1 en bas et ajoutez séquentiellement jusqu’à ce que vous atteigniez la couche 4 en haut. Évitez de déranger les couches lors de l’ajout et de tout mouvement vigoureux qui pourrait provoquer un mélange. Ensuite, ajoutez le milieu de digestion au tissu haché. Placez l’échantillon dans un agitateur dans le bain-marie à 30 degrés Celsius. Ensuite, retirez le mouchoir du bain-marie et laissez-le reposer pendant quelques minutes.

Pour effectuer la trituration, aspirez l’excès de milieu de digestion. Suspendez le tissu dans 2 millilitres de HABG. À l’aide d’une pipette à alésage étroit, triturez 10 fois en 45 secondes et évitez d’introduire de l’air car cela diminuerait considérablement le rendement viable. La trituration est l’une des étapes les plus critiques de la procédure. Le tissu doit être soigneusement aspiré et vidé de la pipette polie au feu, en évitant l’excès de vigueur, qui peut entraîner la mort neuronale, ou en étant trop doux, ce qui entraînera un faible rendement.

Ensuite, aspirez les 2 premiers millilitres du surnageant et transférez-les dans un nouveau tube de 15 millilitres étiqueté « collection ». Répétez les procédures de collecte deux fois de plus pour obtenir 6 millilitres de surnageant. Ensuite, transférez lentement le contenu du tube de collecte dans le tube de gradient préparé précédemment, en évitant de perturber le gradient.

Pour purifier les neurones, centrifugez le tube à gradient pendant 15 minutes à 800 x g et 22 degrés Celsius. Récupérez les couches souhaitées et transférez-les dans un nouveau tube de 15 millilitres. Pour une isolation neuronale de la plus haute pureté, collectez la couche 3. Pour plus de rendement avec moins de pureté, récupérez les couches 2 à 3.

Ensuite, diluez le gradient de densité en ajoutant 5 millilitres de HABG aux couches nouvellement collectées. Centrifugez-le à 200 x g pendant 2 minutes à 22 degrés Celsius. Après 2 minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 5 millilitres de HABG en agitant la pastille. Ensuite, centrifugez à nouveau l’échantillon à 200 x g pendant 2 minutes à 22 degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 3 millilitres de milieu neurobasal en agitant la cuffe.