Souris dans Utero électroporation: contrôlé Transefection Gene spatio-temporelle

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir une transfection génique efficace dans le système nerveux central de la souris embryonnaire à un stade de développement et dans une région cérébrale précisés. Cela est réalisé en premier lieu en préparant des capillaires de précision et des électrodes de type aiguille afin d'éviter tout dommage utérin. La deuxième étape de la procédure consiste à apprendre une méthode de maintien originale des embryons, utilisant un câble lumineux en fibre optique pour visualiser les embryons de petite taille et permettre une injection ciblée de l'ADN.

La troisième étape de la procédure consiste à réaliser une électroporation à l’aide d’électrodes de type baguette sur la surface utérine afin de transfecter l’ADN dans les parties superficielles du cerveau ; la dernière étape consiste à effectuer une électroporation à l’aide d’électrodes de type aiguille dans des structures cérébrales plus profondes, telles que le thalamus et l’hypothalamus. En fin de compte, on peut obtenir des résultats montrant une transfection spécifique selon les couches corticales ou une transfection efficace dans le thalamus. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l’insertion classique en position neutre, réside dans une meilleure visibilité et un meilleur contrôle du site d’insertion des embryons dans l’utérus.

Nous utilisons un câble semblable à un câble en fibre optique, qui permet de visualiser les embryons à partir du stade E 9,5, ainsi que des aiguilles hypodermiques pour transmettre de l'ADN plasmidique dans des régions profondes du cerveau, telles que le thalamus et l'hypothalamus. Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles concernant le développement cérébral, telles que la différenciation neuronale, le schéma d'organisation du cerveau et la connectivité neuronale. Généralement, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il est délicat de façonner l'aiguille, l'électrode et d'obtenir une position adéquate.

L'utérus et les embryons. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour comprendre comment fabriquer des électrodes en aiguille avec précision et comment positionner les embryons afin de les électroporer. Ces deux étapes sont en effet cruciales pour obtenir des résultats concluants. Pour préparer les capillaires, utilisez un tireur de micropipettes conformément aux instructions du fabricant.

Dans cette procédure, nous utilisons des tubes capillaires en verre d'un millimètre de diamètre, sans fibre interne. Les micropipettes étirées doivent avoir une longueur de 800 micromètres à un millimètre depuis l'extrémité, avec un diamètre externe inférieur à 60 micromètres, en utilisant un microscope stéréo et des pinces pour pincer les extrémités des micropipettes afin d'obtenir un diamètre de 20 à 30 micromètres. Mesurer chaque micropipette à l'aide d'un micromètre.

Ensuite, préparez des microélectrodes par enroulement. Enroulez une extrémité d'un fil de tungstène autour d'une broche plaquée or. Utilisez un fil de tungstène pour les électrodes négatives et un fil de platine pour les électrodes positives.

Fixez le fil à la broche à l'aide du param. Insérez ensuite le fil dans la tige en plastique d'un coton-tige et enroulez les deux extrémités avec du phim. Aiguisez uniformément la pointe du fil avec du papier de verre fin jusqu'à ce qu'elle mesure entre 20 et 30 micromètres à l'extrémité et 60 micromètres entre 800 micromètres et un millimètre de la pointe. Vérifiez à nouveau les dimensions finales à l'aide d'un micromètre.

Ensuite, plonger le fil aiguisé dans une goutte de vernis à ongles afin d'appliquer une fine couche sur toute la longueur du fil pour l'isoler. Une fois le vernis à ongles sec, utiliser un coton-tige imbibé d'acétone pour l'éliminer des derniers 200 micromètres de l'extrémité. Les électrodes en platine sont achetées prêtes à l'emploi et ne nécessitent aucune préparation.

Dans cette procédure, nous utilisons l'électrode à gène CUY six 10 P quatre tiret un nepo pour purifier l'ADN plasmatique à l'aide d'une méthode maxi prep ou équivalente, transférant 100 microgrammes d'ADN dans un nouveau tube, puis ajoutons 10 microlitres de colorant Fast Green à 1 %. Utiliser du tampon TE pour ajuster le volume à 100 microlitres afin d'obtenir une concentration finale d'ADN plasmatique de 1 microgramme par microlitre. Mélanger délicatement la solution par aspiration et expulsion à la pipette, puis centrifuger la solution d'ADN pendant cinq minutes à 14 000 tr/min à température ambiante pour éliminer les impuretés et les sels.

Transférez le SNAT dans un nouveau tube. La solution d'ADN peut être conservée à température ambiante dans le tube pendant toute la procédure. Ensuite, reliez une micropipette tirée à un micromanipulateur conformément aux instructions du fabricant, puis immergez la pointe de la pipette dans la solution d'ADN afin de la remplir.

Retirez soigneusement le micromanipulateur et préparez-vous à l'intervention chirurgicale avant l'opération. Pesez une souris gravide aux jours embryonnaires 9,5 à 15,5 afin de déterminer son poids corporel.

Ensuite, injection intrapéritonéale. Injecter du pentobarbital sodique de qualité pharmaceutique à une dose de 50 microgrammes par gramme de poids corporel et observer pendant cinq minutes. Des alternatives au pentobarbital sodique pourraient inclure la kétamine, la xylazine, l'ejection ou les anesthésiques gazeux.

Après anesthésie, utilisez une lame de rasoir et de l’éthanol à 50 % pour raser les poils de l’abdomen. Préparez la peau en effectuant des frictions alternées avec du Bétadine et de l’alcool à 70 %. Pratiquez une incision au niveau de la ligne médiane abdominale à l’aide de ciseaux fins.

Extraire délicatement toutes les cornes utérines sur un tampon de gaze humide en coton imprégné de solution saline tamponnée au phosphate 1 x ou PBS, placé autour de la plaie. Garder l'utérus humidifié avec du PBS en permanence. À l'aide d'un câble à fibre optique souple.

Placer le câble sous la corne utérine. Positionner l'utérus entre la lumière de la fibre optique et le pouce, puis presser doucement pour faire remonter l'embryon vers la paroi utérine. Lorsque l'embryon est positionné avec la tête à gauche et tournée vers le haut, insérer délicatement la capillaire en verre dans le ventricule cible et injecter environ un microlitre de solution d'ADN pour l'électroporation de la couche corticale quatre au jour embryonnaire 13,5.

Placer les électrodes en platine en forme de baguette à l'extérieur de l'utérus et appliquer des impulsions de courant en onde carrée cinq fois en utilisant 38 volts pendant 50 millisecondes. Si l'on utilise l'électroporation microscopique pour atteindre le thalamus ou l'hypothalamus au jour embryonnaire 10,5, insérer l'électrode négative en tungstène fine dans le ventricule injecté avec l'ADN et l'électrode positive en platine dans l'utérus. Placer la région cible entre les extrémités des deux électrodes et appliquer les impulsions de courant en onde carrée recommandées trois fois à sept volts pendant 100 millisecondes.

Une fois l'électroporation terminée, remettre le cornet utérin à son emplacement d'origine et ajouter 500 microlitres de PBS. Suturer la couche interne de l'incision avec un fil chirurgical. Fermer ensuite la couche externe à l’aide d’un clip automatique de neuf millimètres.

Placer la souris sur un coussin chauffant pendant deux heures afin de permettre la récupération après la chirurgie et l'anesthésie. L'électroporation au platine de la région corticale est ici appliquée aux jours embryonnaires 13,5, 14,5 et 15,5. Les cerveaux ont été prélevés à la naissance.

Jour six. La couche de cellules corticales électroporées est clairement différente dans chaque expérience. Cela suggère que l'électroporation dépendante du temps rend possible un gain de fonction et une perte de fonction spécifiques aux couches corticales.

Comme illustré ici, l'électroporation dans un tissu profond tel que le thalamus et l'hypothalamus. L'utilisation d'électrodes en platine rigides donne souvent une faible efficacité, tandis que l'utilisation d'électrodes microscopiques permet d'obtenir une meilleure efficacité et viabilité.

Nous avons injecté une solution d'ADN plasmatique dans le troisième ventricule d'embryons de souris. À 11,5 jours embryonnaires, nous avons appliqué une électroporation par aiguille restreinte au thalamus, car la majeure partie des exons du thalamus projettent vers le cortex d'ici le sixième jour postnatal. Ici, nous démontrons l'électroporation microscopique P-C-A-G-E-Y-F-P dans le cphalon en développement.

La région du thalamus est indiquée par RORC, qui marque tous les neurones post-mitotiques thalamiques. Les projections axonales, montrées par des flèches blanches vers la couche IV du cortex, peuvent également être visualisées par EYFP, qui remplit entièrement le neurone. La position de la couche IV dans le cortex est également marquée par l'anticorps anti-RORC.

Une fois que la MA commence, cette technique peut être réalisée en 15 minutes par litre si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se souvenir de manipuler le test avec précaution afin d'éviter tout dommage. D'autres méthodes, telles que l'incorporation d'un chromo spécifique dans l'ADN mitochondrial, peuvent être réalisées afin de comprendre le mécanisme moléculaire de la spécification cellulaire après son développement.

Cette technique offre aux chercheurs dans le domaine du développement du système nerveux central un moyen d'explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans le balisage, la croissance axonale et la formation de circuits.