Édition du génome basée sur les nucléases à doigts de zinc : une technique de modification du génome dans les cellules souches pluripotentes humaines par un mécanisme de réparation dépendant de l’homologie double brin
Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 6:34 min • July 8th, 2025
La nucléase à doigt de zinc ou ZFN contient un macro-domaine de liaison à l’ADN stabilisé par des ions zinc, connecté à un domaine endonucléase via un agent de liaison. Cette structure aide à maintenir la spécificité tout en coupant l’ADN.
Pour utiliser les ZFN pour l’édition du génome, prenez une culture de cellules souches pluripotentes humaines. Complétez-le avec un plasmide codant pour ZFN. Ajoutez un plasmide de réparation contenant le gène cible et le gène de résistance aux antibiotiques pris en sandwich entre des bras d’homologie ou HA. Électroporat le mélange cellule-ADN où le courant électrique facilite l’entrée des plasmides à l’intérieur de la cellule.
Une fois à l’intérieur, les motifs en doigts de zinc de ZFN traduits se lient aux triplets de paires de bases complémentaires dans le génome hôte, positionnant correctement l’endonucléase de restriction Fok-1 sur le site cible. Les ZFN se lient à des brins opposés par paires, ce qui permet à l’homodimérisation de Fok-1 de former un centre catalytique actif dans lequel Fok-1 génère des cassures double brin d’ADN ou DSB, produisant un surplomb de quatre nucléotides.
La présence d’AH dans le plasmide de réparation guide la ré
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