Édition du génome basée sur les nucléases à doigts de zinc : une technique de modification du génome dans les cellules souches pluripotentes humaines par un mécanisme de réparation dépendant de l’homologie double brin

La nucléase à doigt de zinc ou ZFN contient un macro-domaine de liaison à l’ADN stabilisé par des ions zinc, connecté à un domaine endonucléase via un agent de liaison. Cette structure aide à maintenir la spécificité tout en coupant l’ADN.

Pour utiliser les ZFN pour l’édition du génome, prenez une culture de cellules souches pluripotentes humaines. Complétez-le avec un plasmide codant pour ZFN. Ajoutez un plasmide de réparation contenant le gène cible et le gène de résistance aux antibiotiques pris en sandwich entre des bras d’homologie ou HA. Électroporat le mélange cellule-ADN où le courant électrique facilite l’entrée des plasmides à l’intérieur de la cellule.

Une fois à l’intérieur, les motifs en doigts de zinc de ZFN traduits se lient aux triplets de paires de bases complémentaires dans le génome hôte, positionnant correctement l’endonucléase de restriction Fok-1 sur le site cible. Les ZFN se lient à des brins opposés par paires, ce qui permet à l’homodimérisation de Fok-1 de former un centre catalytique actif dans lequel Fok-1 génère des cassures double brin d’ADN ou DSB, produisant un surplomb de quatre nucléotides.

La présence d’AH dans le plasmide de réparation guide la réparation dépendante de l’homologie où l’extrémité en surplomb s’inverse et utilise la séquence HA homologue comme modèle. La synthèse de l’ADN se poursuit par l’ajout de nucléotides complémentaires au gène cible.

Les espaces qui en résultent sont ligaturés, ce qui facilite l’insertion du gène. De plus, le gène de résistance aux antibiotiques sans promoteur est exprimé à partir d’un promoteur hôte en amont du site d’insertion. Les cellules modifiées avec succès se développent dans le milieu de sélection d’antibiotiques.

Commencez par cultiver des cellules souches pluripotentes humaines dans un milieu hESC sur une plaque à 6 puits contenant des cellules nourricières de fibroblaste embryonnaire de souris inactivées (MEF) inactivées à la mitomycine C cultivées sur de la gélatine. Chaque jour suivant le placage, jusqu’à ce que le hPSC ait atteint 50 % de confluence, utilisez une pipette en verre et mettez sous vide pour prélever tout le volume de support. Remplacer par 3 millilitres de média hESC chaud par puits.

Un jour avant le ciblage, retirez le milieu hESC et ajoutez un milieu hESC frais préchauffé complété par 10 micromolaires Y27632. Préparez également une à deux plaques à 6 puits de cellules nourricières MEF résistantes aux médicaments à partir de souris DR4. Le jour du ciblage, préparez les solutions de transfection en pipetant 5 microgrammes de plasmides d’expression de nucléases à doigts de zinc 1 et 2 dans un tube de 1,5 millilitre.

Ajoutez 30 microgrammes de plasmide donneur de réparation, suivis de suffisamment de solution saline tamponnée au phosphate 1X pour porter le volume à 300 microlitres. Inspectez les cellules au microscope pour vous assurer que la confluence est de 50 %. Ensuite, utilisez une pipette en verre et mettez le vide pour retirer le milieu de la plaque de hPSC. Ensuite, lavez les cellules avec 2 millilitres de 1X PBS chaud. Après avoir aspiré le PBS, ajoutez 0,5 millilitre de solution de trypsine EDTA à 0,25 %, directement sur les cellules.

Placer dans l’incubateur de culture tissulaire pendant environ 10 minutes, ou jusqu’à ce que la couche nourricière commence à se détacher de la plaque. Après l’incubation, ajoutez 2 millilitres de milieu esWash chaud dans chaque puits pour arrêter la réaction de la trypsine. Collectez les cellules de chaque puits, en vous assurant que les cellules nourricières se détachent comme une feuille. Pipetez le contenu de chaque puits dans un seul tube conique de 50 millilitres, en combinant tous les puits, et triturez les cellules à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres.

Ajoutez le média esWash pour porter la suspension cellulaire à 40 millilitres. Attendez une à deux minutes pour permettre aux gros morceaux de se déposer au fond du tube, puis retirez le surnageant à l’aide d’une pipette sérologique et déposez-le dans un tube conique frais de 50 millilitres. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire pendant cinq minutes à 190 x g, aspirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de 1X PBS.

Combinez les cellules remises en suspension avec la solution de transfection de plasma préparée précédemment. Pipetez les cellules et le mélange de transfection dans une cuvette d’électroporation de 4 millimètres et placez-les sur de la glace pendant trois à cinq minutes. Réglez les paramètres du programme exponentiel sur le système d’électroporation à 250 volts, 500 microFarads, résistance infinie et taille de cuvette de 4 millimètres. Électroporez les cellules, puis replacez la cuvette sur de la glace pendant trois minutes.

Remettre en suspension les cellules électroporées dans 18 millilitres de milieu hESC chaud complété par 10 micromolaires Y27632. Inspectez les MEF DR4 au microscope. Plaquez 3 millilitres de suspension unicellulaire dans chaque puits d’une plaque à 6 puits contenant des cellules nourricières DR4, et retournez dans l’incubateur. Le troisième jour après le placage, remplacez le milieu sur les cellules par un milieu hESC sans Y27632. Le jour 4, remplacez le milieu non supplémenté par un milieu contenant l’antibiotique de sélection approprié. Puromycine est utilisé ici.