Silençage génique basé sur l’interférence CRISPR : une technique de répression ciblée de la fonction des gènes chez les leptospires pathogènes

L’interférence CRISPR ou CRISPRi, utilise une variante désactivée de Cas9, dCas9, pour le silençage génique ciblé, qui réprime la fonction des gènes.

Pour effectuer CRISPRi, utilisez une construction de vecteur navette - un plasmide contenant des origines de réplication correspondant à la fois aux bactéries E. coli et Leptospira, facilitant la propagation chez les deux espèces.

Le vecteur contient également une séquence spécifique du gène dCas9 et un ARN monoguide ou sgRNA, pour reconnaître la séquence cible.

Initialement, le vecteur navette est présent à l’intérieur du donneur E. coli. Compléter la culture d’E. coli donneuse avec l’hôte Leptospira pour faciliter la conjugaison. La conjugaison établit un contact direct de cellule à cellule entre les organismes, facilitant l’absorption du plasmide navette par Leptospira. À l’intérieur de la cellule, la construction plasmidique produit des séquences d’ARNsg et exprime les protéines dCas9.

L’ARNsg contient une région protospacer qui reconnaît sa région cible complémentaire sur l’ADN Leptospira, près du motif adjacent protospacer ou PAM - une courte séquence de reconnaissance sur l’ADN hôte. Cela aide dCas9 à former un complexe avec l’ARNsg au site cible en aval du site de début de transcription du gène.

Le dCas9 du complexe sgRNA-dCas9 n’a pas l’activité catalytique nécessaire pour cliver les brins d’ADN, mais agit plutôt comme une barrière physique pour le mouvement de l’enzyme ARN polymérase formant l’ARNm, inhibant finalement la transcription des gènes. Utilisez le Leptospira silencieux pour des tests supplémentaires.

Pour la conjugaison, les cellules de Leptospira sont cultivées à 29 ou 37 degrés Celsius dans un milieu HAN. Un jour avant la conjugaison, les cellules E. coli du donneur sont cultivées dans un milieu LB complété par de l’acide diaminopimélique (DAP) et de la spectinomycine.

Ensuite, le jour de la conjugaison, cultivez les cultures saturées d’E. coli dans LB plus DAP. À l’intérieur d’une hotte de biosécurité, assemblez l’appareil de filtration en plaçant le filtre à membrane sur la base en verre, puis sur un entonnoir en verre de 15 ml. Les deux pièces sont maintenues ensemble par la pince à ressort. Ensuite, connectez le verre à une pompe à vide. Ajoutez 5 ml de cultures de Leptospira dans l’entonnoir.

Ensuite, ajoutez la souche β2163 d’E. coli contenant le plasmide d’intérêt. Le volume variera en fonction de la densité optique de la culture. Nous visons une proportion de cellules de 1:1. Tournez la pompe à vide. Maintenant, les liquides passeront à travers la membrane et les cellules seront concentrées sur celle-ci.

Prenez le filtre et placez-le sur une plaque EMJH plus un DAP, côté bactérien vers le haut. Incuber les plaques à 29 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, récupérez les filtres des plaques et placez-les dans un tube conique de 50 ml.

Utilisez 1 mL de média HAN liquide pour récupérer les cellules du filtre par pipetage. Visualisez les cellules récupérées par microscopie à fond noir.

À ce stade, on peut observer un nombre équivalent d’E. coli et de Leptospires. 100 à 200 microlitres sont utilisés pour propager la bactérie sur deux plaques HAN contenant de la spectinomycine. À ce stade, le DAP est omis, et E. coli ne se développe pas. Les plaques sont incubées à 37 degrés Celsius et 3 % de CO₂. Les colonies devraient être apparentes entre 8 et 10 jours.