Silençage génique basé sur l’interférence CRISPR : une technique de répression ciblée de la fonction des gènes chez les leptospires pathogènes

L’interférence CRISPR ou CRISPRi, utilise une variante désactivée de Cas9, dCas9, pour le silençage génique ciblé, qui réprime la fonction des gènes.

Pour effectuer CRISPRi, utilisez une construction de vecteur navette - un plasmide contenant des origines de réplication correspondant à la fois aux bactéries E. coli et Leptospira, facilitant la propagation chez les deux espèces.

Le vecteur contient également une séquence spécifique du gène dCas9 et un ARN monoguide ou sgRNA, pour reconnaître la séquence cible.

Initialement, le vecteur navette est présent à l’intérieur du donneur E. coli. Compléter la culture d’E. coli donneuse avec l’hôte Leptospira pour faciliter la conjugaison. La conjugaison établit un contact direct de cellule à cellule entre les organismes, facilitant l’absorption du plasmide navette par Leptospira. À l’intérieur de la cellule, la construction plasmidique produit des séquences d’ARNsg et exprime les protéines dCas9.

L’ARNsg contient une région protospacer qui reconnaît sa région cible complémentaire sur l’ADN Leptospira, près du motif adjacent protospacer ou PAM - une courte séquence de reconnaissance sur l’ADN hôte. Cela aide dCas9 à former un complexe avec l’