Édition de gènes médiée par Morpholino : une technique d’inactivation de gènes utilisant des oligonucléotides Morpholino bloquant la traduction dans des œufs de poissons cavernicoles unicellulaires

Les morpholinos sont des oligonucléotides courts, monocaténaires, redessinés, avec des différences dans leur squelette phosphate et leur structure sucrée par rapport aux nucléotides naturels. Ces caractéristiques améliorent la stabilité des morpholinos au pH physiologique. Malgré ces variations, les morpholinos contiennent les nucléobases standard, qui aident à concevoir des oligonucléotides complémentaires à la séquence d’ARNm spécifique d’un gène cible souhaité à éliminer.

Pour effectuer une édition de gènes pilotée par le morpholino, commencez par prélever des œufs de poissons cavernicoles unicellulaires placés à l’intérieur des puits d’une plaque d’injection d’agarose. Visualisez les œufs translucides et ronds pour localiser le sac vitellin - une structure remplie de liquide présente à l’intérieur de l’œuf.

Prenez une aiguille de micro-injection pré-remplie d’une solution contenant des morpholinos. Injectez la solution directement dans le jaune d’œuf, en veillant à ce que les morpholinos pénètrent dans le cytoplasme cellulaire. À l’intérieur des cellules, le gène cible forme l’ARNm, qui est transporté vers le cytoplasme.

Dans le cytoplasme, le morpholino injecté s’hybride avec son transcrit d’ARNm cible complémentaire au site d’initiation endogène et s’étend au-delà. Ce processus bloque la liaison de la plus grande sous-unité du ribosome avec le complexe d’initiation de traduction naissant constitué d’une petite sous-unité ribosomique complexée avec des protéines spécifiques.

Par la suite, la progression du complexe d’initiation de la traduction est stériquement entravée, ce qui arrête la traduction de l’ARNm dans la protéine. Enfin, la concentration en protéines cibles diminue en raison du blocage traductionnel par les morpholinos.

Le jour de l’injection, à l’aide d’une pipette en verre, transférez les ovules unicellulaires dans la plaque d’injection, en remplissant jusqu’à cinq rangées de la plaque d’injection avec 30 à 40 œufs par rangée. Gardez les œufs hydratés avec une petite quantité d’eau du système de poisson. Décongelez le morpholino sur de la glace et préparez la solution d’injection de manière à ce que 400 picogrammes de morpholino soient injectés par œuf, en utilisant une longue pointe de pipette Microloader ou en ajoutant un bolus de 2 à 4 microlitres à la fin.

Lorsque toutes les aiguilles ont été chargées, utilisez une pince pour couper l’excès de longueur des pointes de l’aiguille d’injection et montez la première aiguille dans un micromanipulateur connecté à un micro-injecteur de picolitres. Ensuite, placez la boîte d’injection sous un microscope de dissection et utilisez le micromanipulateur pour pénétrer chaque œuf avec l’aiguille, avant d’injecter 1 nanolitre de solution d’injection de morpholino directement dans le jaune.