Chargement de billes pour introduire des acides nucléiques dans des cellules cultivées adhérentes : une technique pour charger des plasmides codant pour des protéines fluorescentes dans des cellules de mammifères adhérents

Commencez par une culture de cellules de mammifères adhérentes dans une plaque de culture. Transférez des billes de verre stérilisées, traitées à l’alcali, de taille d’un micron, dans la chambre d’un appareil de chargement de billes personnalisé. Couvrez l’ouverture de la chambre à l’aide d’un treillis avec des ouvertures de taille optimale pour permettre aux billes de passer à travers pendant le chargement. Fixez le treillis à l’aide d’une chambre d’imagerie.

Retirez le support de la plaque. Pipeter une suspension d’ADN plasmidique codant pour une protéine rapporteure fluorescente dans la plaque pour une distribution uniforme sur les cellules. À l’aide de l’appareil de chargement de billes, dispersez doucement une monocouche de billes de verre sur les cellules. Tapotez brièvement la plaque de culture avec la force appropriée.

Les billes de verre roulent brièvement sur les cellules adhérentes, tandis que le traitement alcalin les rend moins adhérentes aux cellules. L’impact des collisions entre les billes et les cellules transmet une tension adéquate, créant des perturbations localisées dans les membranes cellulaires. Ces pores transitoires formés de petites dimensions facilitent l’absorption de l’ADN plasmidique dans les cellules tout en empêchant l’entrée de grosses billes.

Pendant la période de récupération, la membrane cellulaire se referme, restaurant l’intégrité de la membrane et piégeant l’ADN plasmidique. Ajoutez du support dans la plaque et aspirez soigneusement toutes les perles flottantes visibles de la plaque. Incuber l’assiette.

Les cellules transfectées avec succès contenant de l’ADN plasmidique expriment les protéines rapporteures fluorescentes, qui peuvent être visualisées au microscope à fluorescence.

Retirez le milieu des cellules et aspirez doucement tout le milieu sur les bords de la chambre. Ensuite, inclinez la chambre à un angle d’environ 45 degrés et retirez la goutte de média restante dans le micropuits central. Pipetez doucement la solution de chargement des billes sur le micropuits en verre présent au centre de la chambre.

Utilisez l’appareil de chargement de billes pour disperser doucement une monocouche de billes de verre sur le dessus des cellules. Assurez-vous que les billes recouvrent complètement les cellules. Pincez la chambre avec deux doigts. Soulevez-le d’environ deux pouces et abaissez-le fermement en utilisant une force à peu près équivalente à la chute du plat de cette hauteur.

Rajoutez doucement le fluide dans la chambre en le pipetant lentement sur le côté en plastique de la chambre. Aspirez les billes flottantes sans déranger les cellules. L’ensemble de la procédure de chargement des billes doit être effectuée relativement rapidement, afin que les cellules ne se dessèchent pas lorsqu’elles sont sans fluide. Ensuite, incubez les cellules pendant 0,5 à 2 heures dans l’incubateur.