Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 5:33 min • July 8th, 2025
Commencez avec un volume optimal de billes d’or - des véhicules de livraison de gènes biologiquement inertes et non toxiques - dans un tube de microcentrifugation. Ensuite, ajoutez des agents cationiques - spermidine et chlorure de calcium, suivis des fragments d’ADN souhaités aux perles d’or. Effleurez doucement le tube et incuber.
Le chlorure de calcium se lie aux fragments d’ADN et facilite leur enrobage sur les billes d’or via les résidus de spermidine. Ensuite, centrifugez et retirez le solvant. Remettre en suspension les billes enrobées d’ADN dans de l’éthanol. Pipetez doucement les billes sur un disque macroporteur stérile. Laissez sécher.
Mettre en place un appareil de canon à gènes biolistiques comprenant un tube d’accélération de gaz hélium et une chambre de bombardement avec un disque de rupture et un écran d’arrêt dans leurs fentes respectives. Ensuite, retournez le disque macroporteur et chargez-le sous le disque de rupture.
Par la suite, placez les cellules hôtes cibles cultivées dans un milieu solide approprié complété par du sorbitol - un stabilisant osmotique pour améliorer l’efficacité de la transformation. Une fois la configuration prête, tirez avec le pistolet à gènes.
Au fur et à mesure que l’hélium se déplace dans le tube d’accélération, la pression continue de s’accumuler jusqu’à ce que le disque de rupture se brise, créant des ondes de choc à l’hélium. Ces ondes de choc entraînent le disque macroporteur transportant les perles d’or vers l’écran d’arrêt, qui ne laisse passer que les perles d’or.
Les billes d’or accélérées pénètrent dans le noyau de la cellule hôte, intégrant l’ADN souhaité dans le génome de la cellule hôte.
Commencez par utiliser des pinces pour immerger des disques biologiques macroporteurs orange dans de l’éthanol à 100 %, puis transférez les disques dans une grande boîte de Pétri contenant de la diérite, en veillant à ce que les disques ne touchent pas le déshydratant. Une fois secs, pressez les disques dans des supports de disques argentés essuyés à l’éthanol, puis vortex un tube de perles d’or et aliquote 12 microlitres de la solution de billes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre par transformation.
Ensuite, ajoutez séquentiellement 2 microgrammes d’ADN, 10 microlitres de chlorure de calcium et deux microlitres de base libre de spermidine dans chaque tube de billes. Vortex chaque échantillon, puis incubez les tubes à température ambiante pendant 5 minutes, avec un léger effleurement occasionnel pour remettre en suspension les billes décantées.
À la fin de l’incubation, granulez les billes d’or recouvertes d’ADN et aspirez soigneusement le surnageant. Remettez lentement les billes en suspension complètement dans 600 microlitres d’éthanol à 100 %, puis granulez à nouveau les cellules, cette fois en remettant les billes en suspension dans 8 microlitres d’éthanol.
Maintenant, distribuez chaque tube de billes au centre d’un disque biolistique individuel en cercles de 1 centimètre de diamètre. Si une concentration suffisante de perles est présente, un cercle doré sera visible au centre de chaque disque une fois que les perles seront sèches.
Pour faire fonctionner le pistolet à gènes, allumez d’abord la pompe à vide, puis tournez le bouton du réservoir d’hélium dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce qu’une pression d’environ 2200 PSI soit atteinte sur le manomètre. Ensuite, actionnez l’interrupteur rouge gauche pour allumer le pistolet à gènes et ajustez les débits du vide et de l’évent de sorte que le vide atteigne 28 pouces de mercure en 15 secondes. Confirmez que la distance entre le disque de rupture et le macrotransporteur est d’environ 3/8e de pouce à ce moment également.
Lorsque tout est en place, essuyez toute la chambre avec de l’éthanol à 70 % et immergez les disques de rupture dans de l’éthanol à 100 %. Après avoir séché les disques sur une surface stérile, utilisez une clé dynamométrique pour desserrer le support du disque de rupture et insérez un disque propre. Revissez le support de disque de rupture en place et tournez-le une fois vers la droite avec la clé dynamométrique pour le serrer.
Ensuite, immergez les tamis à mailles dans de l’éthanol à 100 %. Une fois sec, placez un écran sur la plaque de montage en plastique blanc et placez le support de disque macroporteur, côté ADN vers le bas, dans la chambre du disque. Vissez le capuchon argenté et placez la plaque de montage dans la fente la plus haute, puis placez une plaque de gélose YPD contenant 1 molaire de sorbitol sur la plaque inférieure.
Maintenant, fermez la porte de la chambre et verrouillez-la en place, puis poussez et maintenez l’interrupteur rouge du milieu en position haute pour engager le vide et lui permettre d’atteindre 28 pouces de mercure. Une fois que le niveau de vide approprié est atteint et que l’interrupteur du milieu a été déplacé en position basse, maintenez l’interrupteur rouge droit enfoncé pour tirer.
Lorsque le disque de rupture éclate, relâchez immédiatement le bouton de tir et poussez l’interrupteur rouge du milieu en position médiane afin de ventiler la chambre à 0 PSI. Si le tir a réussi, un anneau doré sera visible sur la plaque. Nettoyez les débris du disque de rupture et du disque macroporteur, éteignez le pistolet à gènes, puis tournez le bouton du réservoir d’hélium dans le sens des aiguilles d’une montre pour éteindre le gaz et éteindre la pompe à vide.