Coloration périodique à l’acide des cellules : une technique in vitro pour détecter les niveaux de glycogène dans les cellules mononucléées du sang périphérique

Les cellules mononucléées du sang périphérique, ou PBMC, sont des cellules sanguines circulatoires avec des noyaux uniques et volumineux, comprenant des lymphocytes B et T, des cellules tueuses naturelles, des monocytes et des cellules dendritiques. Les PBMC stockent l’excès de glucose sous forme polymérique sous forme de glycogène - un polysaccharide ramifié - dans leur cytoplasme.

Pour détecter la présence de glycogène dans les PBMC, préparez un frottis uniforme de PBMC isolés sur une lame de verre. Traitez les cellules avec du formol - une solution fixatrice, qui relie les biomolécules cellulaires, préservant ainsi l’intégrité structurelle des PBMC.

Immerger partiellement la lame dans une solution d’amylase. Cette enzyme pénètre dans les cellules et hydrolyse le glycogène dans les cellules traitées. Il en résulte deux populations cellulaires distinctes : les cellules riches en glycogène traitées aux enzymes, déficientes en glycogène et les cellules riches en glycogène non traitées à l’amylase.

Recouvrez-les d’une solution acide périodique qui convertit par oxydation les groupes hydroxyles des molécules de glycogène en aldéhydes.

Rincez la lame à l’eau pour arrêter la réaction d’oxydation et éliminer l’excès d’acide périodique. Traitez la lame avec le réactif Schiff, qui réagit avec les groupes aldéhydes du glycogène périodique traité à l’acide, générant un complexe insoluble de couleur magenta.

Appliquez un support de montage pour retenir les cellules pendant l’imagerie. Placez une lamelle pour répartir le support de montage sur toute la surface de la diapositive pour une meilleure visualisation. Imagez les cellules colorées.

Les cellules non traitées à l’amylase contiennent des granules de glycogène magenta, absents dans les cellules traitées aux enzymes.

Dans cette étape, placez la diapositive sur une surface plane. Appliquez 2 millilitres de solution d’acide périodique sur l’échantillon et incubez pendant 5 minutes à température ambiante. Ensuite, rincez la lame plusieurs fois à l’eau distillée. Appliquez 2 millilitres de réactif de Schiff sur la lame et incubez à température ambiante pendant 15 minutes.

Ensuite, lavez la lame à l’eau distillée pendant 5 minutes, puis laissez-la sécher à l’air. Ensuite, appliquez un support de montage de 100 microlitres sur la diapositive et couvrez-la d’une grande lamelle, ou appliquez 50 microlitres et utilisez deux petites lamelles. Après cela, appliquez du vernis à ongles transparent sur les bords de la lamelle. Laissez-les sécher toute la nuit.

Ensuite, obtenez des images avec le microscope à lumière binoculaire à l’aide de l’objectif 100X.