Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 3:10 min • July 8th, 2025
Commencez par traiter l’échantillon de protéines avec un tampon dénaturant composé d’un détergent - le dodécylsulfate de sodium, SDS, et d’un agent réducteur - bêta-mercaptoéthanol. Réchauffez-le brièvement. Au cours de cette étape, le bêta-mercaptoéthanol perturbe les liaisons disulfure, rendant une conformation dépliée à la protéine.
Les protéines dépliées avec leurs acides aminés hydrophobes exposés se lient au SDS chargé négativement et acquièrent une charge négative uniforme. Ajoutez un colorant de suivi approprié à l’échantillon pour une visualisation en temps réel.
Maintenant, chargez l’échantillon et le marqueur de taille moléculaire standard dans des puits séparés présents dans le gel d’empilement - la couche supérieure du gel de polyacrylamide contenant une concentration plus faible de polymères d’acrylamide réticulés.
Connectez l’appareil de gel rempli de tampon à l’alimentation électrique.
En présence d’un champ électrique, les protéines chargées négativement migrent librement vers l’anode et s’empilent pour pénétrer dans le gel de résolution - la couche inférieure contenant un gel de concentration plus élevée.
Dans le gel de résolution, les protéines commencent à migrer en fonction de leur taille moléculaire, les protéines plus petites migrant rapidement, ce qui permet d’obtenir des bandes de protéines résolues de manière optimale. Ensuite, arrêtez la course et retirez le gel.
Teindre le gel avec un colorant anionique, le bleu Coomassie, qui se lie électrostatiquement aux acides aminés de base des protéines, leur conférant une coloration bleue. Ensuite, décolorez le gel dans une solution d’acide acétique pour une meilleure visualisation.
Retirez le gel et identifiez les protéines séparées en fonction de leur poids moléculaire estimé.
Préparez deux gels de séparation comme décrit dans le manuscrit du texte. Versez le gel entre les plaques de verre à l’aide d’une pipette de 1 millilitre, en veillant à ce que les 2 centimètres supérieurs soient exempts du mélange. Ajoutez 70 % d’éthanol sur le gel de séparation, créant ainsi une interface uniforme entre les deux couches.
Une fois que les gels de séparation ont polymérisé, préparez les gels d’empilage en suivant les instructions du manuscrit. Ensuite, retirez l’éthanol des gels de séparation et ajoutez la solution de gel d’empilement. Insérez soigneusement un peigne avec le nombre de poches souhaité, sans introduire de bulles d’air, et laissez le gel polymériser pendant 20 à 30 minutes.
Chargez 4 microlitres de chaque échantillon, ainsi que l’échelle protéique, dans des puits séparés. Ensuite, faites couler le gel dans un tampon de coulage Tris-Glycine à 144 volts pendant 45 minutes à température ambiante. Utilisez la solution Fairbanks A préchauffée pour teindre les gels sur un rocker pendant 30 minutes, et la solution Fairbanks D préchauffée pour décolorer les gels sur un rocker jusqu’à ce que l’arrière-plan souhaité soit obtenu.