Dosage par pull-down d’une seule molécule pour l’analyse de la phosphorylation des protéines : une technique à haut débit pour quantifier la phosphorylation des protéines dans le lysat cellulaire

La phosphorylation de certaines protéines cellulaires est importante pour leur fonction biologique.

Pour quantifier les niveaux de phosphorylation de protéines intactes à l’aide d’un test de traction à molécule unique, commencez par prendre une lamelle en verre avec un motif de quadrillage. Chaque compartiment est recouvert de polyéthylène glycol biotinylé ou d’agents de liaison à base de PEG intercalés avec du PEG normal pour éviter toute entrave stérique lors de la liaison aux protéines.

Traiter la lamelle avec un réactif réducteur pour minimiser l’autofluorescence lors de l’analyse. Recouvrir la lamelle avec des neutravidines - des protéines de liaison à la biotine - et incuber, ce qui leur permet de se lier aux liaisons PEG biotinylées.

Complétez le réseau avec des anticorps anti-protéines cibles spécifiques. Chaque anticorps contient de la biotine liée à sa région Fc, ce qui aide à ancrer l’anticorps à la neutravidine, provoquant une immobilisation.

Maintenant, ajoutez le lysat de culture cellulaire contenant diverses protéines, y compris les variantes phosphorylées et non phosphorylées marquées en fluorescence verte de la protéine cible, et incubez. Les deux variantes de la p