Dosage par pull-down d’une seule molécule pour l’analyse de la phosphorylation des protéines : une technique à haut débit pour quantifier la phosphorylation des protéines dans le lysat cellulaire

La phosphorylation de certaines protéines cellulaires est importante pour leur fonction biologique.

Pour quantifier les niveaux de phosphorylation de protéines intactes à l’aide d’un test de traction à molécule unique, commencez par prendre une lamelle en verre avec un motif de quadrillage. Chaque compartiment est recouvert de polyéthylène glycol biotinylé ou d’agents de liaison à base de PEG intercalés avec du PEG normal pour éviter toute entrave stérique lors de la liaison aux protéines.

Traiter la lamelle avec un réactif réducteur pour minimiser l’autofluorescence lors de l’analyse. Recouvrir la lamelle avec des neutravidines - des protéines de liaison à la biotine - et incuber, ce qui leur permet de se lier aux liaisons PEG biotinylées.

Complétez le réseau avec des anticorps anti-protéines cibles spécifiques. Chaque anticorps contient de la biotine liée à sa région Fc, ce qui aide à ancrer l’anticorps à la neutravidine, provoquant une immobilisation.

Maintenant, ajoutez le lysat de culture cellulaire contenant diverses protéines, y compris les variantes phosphorylées et non phosphorylées marquées en fluorescence verte de la protéine cible, et incubez. Les deux variantes de la protéine cible sont capturées par les anticorps, formant des complexes. Lavez pour éliminer les protéines non liées.

Ensuite, traitez ces complexes avec le deuxième ensemble d’anticorps marqués à la fluorescence rouge, qui se lient exclusivement aux résidus phosphorylés de la protéine, transmettant un signal de fluorescence différent au complexe.

Imagez le réseau à l’aide d’un microscope à fluorescence et observez deux signaux de fluorescence distincts. La colocalisation des deux signaux de fluorescence indique la présence de protéines phosphorylées dans l’échantillon.

Retirez les matrices fonctionnalisées à la biotine-PEG du congélateur et équilibrez-les à température ambiante. Placez la lamelle avec le réseau vers le haut sur une boîte de culture tissulaire de 100 millimètres recouverte d’un film d’étanchéité. Incuber chaque carré du réseau avec 10 milligrammes par millilitre de borohydrure de sodium et de PBS pendant 4 minutes à température ambiante. Lavez trois fois avec du PBS.

Ensuite, incubez avec 0,2 milligramme par millilitre de NeutrAvidin dans T50 pendant 5 minutes, puis lavez trois fois avec T50-BSA. Répétez l’incubation avec 2 microgrammes par millilitre d’anticorps biotinylés spécifiques du POI dans le T50-BSA pendant 10 minutes, puis lavez-vous.

Tout d’abord, décongelez et mélangez le lysat par pipetage. Diluez 1 microlitre de lysat dans 100 microlitres de T50-BSA/PPI glacé. Incuber le lysat sur le réseau pendant 10 minutes, suivi d’un lavage. Préparez l’anticorps anti-phosphotyrosine conjugué à l’AF647 dans du T50-BSA/PPI, glacé, et incubez sur le réseau pendant 1 heure.

Déposez une goutte d’huile sur l’objectif. Placez la nanogrille sur la scène pour l’imagerie. À l’aide de la lumière blanche transmise, concentrez-vous sur le motif de la grille. Acquérez une série de 20 images de la grille. Assurez-vous que les pixels ne sont pas saturés et enregistrez la série d’images sous la forme « Fiable ».

Défocalisez la nanogrille pour créer un motif Ary. Acquérez une série de 20 images pour l’étalonnage du gain et enregistrez l’image sous le nom « Gain ». Ensuite, acquérez une série de 20 images pour le décalage de l’appareil photo en bloquant toute la lumière de l’appareil photo, et enregistrez l’image en tant qu'« Arrière-plan ».

Pour acquérir des images SiMPull, nettoyez d’abord l’objectif d’huile et déposez de l’huile supplémentaire sur l’objectif. Fixez le réseau de lamelles sur la platine du microscope. Acquérez des images pour chaque échantillon, d’abord dans le canal rouge lointain, puis dans les fluorophores de plus faible longueur d’onde. Vérifiez le niveau de la mémoire tampon toutes les 30 à 45 minutes et réapprovisionnez-la au besoin.