Criblage enzymatique à base de biomasse chromogène insoluble : un test pour évaluer l’activité de dégradation des enzymes de dégradation de la biomasse végétale

La biomasse est une matière organique d’origine végétale composée principalement de polysaccharides complexes. Les enzymes dégradant les glucides agissent sur ces polysaccharides pour produire des oligosaccharides plus petits.

Pour évaluer l’activité de dégradation d’une enzyme, il faut commencer par prendre différents substrats de biomasse chromogène insoluble - ICB présents dans les puits d’une plaque réactionnelle poreuse. Ces substrats sont obtenus à partir de matériaux d’origine végétale teinturants avec un colorant chlorotriazine de couleur spécifique. La biomasse résultante a des polysaccharides complexes marqués à un colorant servant de substrat pour l’activité enzymatique.

Maintenant, ajoutez une solution tampon contenant une enzyme hydrolysante des glucides. Le tampon maintient le pH pour une activité enzymatique optimale. Placez la plaque de réaction sur un agitateur et incubez. L’agitation constante permet aux molécules enzymatiques d’atteindre le polysaccharide cible dans le substrat de l’ICB.

Pendant l’incubation, l’enzyme hydrolysante clive les liaisons glycosidiques covalentes dans les polysaccharides à longue chaîne. La réaction produit des oligosaccharides solubles liés à des molécules de colorant, qui restent dans la solution.

Une fois la dégradation terminée, placez la plaque de réaction sur une plaque de produit et centrifugez l’ensemble. Lors de la centrifugation, la solution colorée contenant les produits de réaction passe à travers le filtre au fond de la plaque et est collectée dans la plaque du produit. À l’aide d’un lecteur de plaques, notez l’absorbance du surnageant.

Une valeur d’absorbance plus élevée indique la génération d’un grand nombre d’oligosaccharides liés à des colorants, ce qui indique l’efficacité de l’enzyme à dégrader le substrat ICB.

Pour effectuer le test chromogène avec de la biomasse chromogène insoluble rouge, ou paille de blé ICB, commencez par ajouter 200 microlitres de solution d’activation dans chaque puits de la plaque de test. Ensuite, incubez la plaque à température ambiante, sans agitation pendant 10 minutes.

Retirez le stabilisant en utilisant 100 microlitres d’eau stérile pour laver les puits trois fois. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de tampon d’acétate de sodium de 100 millimolaires, pH 4,5, et 5 microlitres de 10 unités par millilitre de solution d’endo-xylanase différente.

Positionnez la plaque de produit sous la plaque de substrat pour recueillir toute fuite potentielle de la plaque de substrat pendant l’agitation, et incubez la réaction à température ambiante et à 100 tr/min pendant 2 heures.

Après l’incubation, placez la plaque du kit de dosage, avec la plaque de produit en dessous, dans la centrifugeuse, et tournez-la à 2 700 x g pendant 10 minutes pour transférer le produit de réaction dans les puits de la plaque de produit.

Vérifiez que le volume de liquide dans chaque puits est à peu près le même. Ensuite, à l’aide d’un lecteur de plaques, lire l’absorbance de la plaque collectrice à 517 nanomètres pour la paille rouge ICB-blé.