Action capillaire radiale différentielle du dosage du ligand : une technique à haut débit pour identifier les protéines intracellulaires de liaison au second messager du nucléotide bactérien

Les bactéries produisent des seconds messagers nucléotidiques, les NSM - molécules de signalisation intracellulaire - en réponse à des stimuli appropriés. Ces molécules se lient aux protéines cibles et régulent les fonctions bactériennes.

Pour identifier ces protéines cibles à l’aide de l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands, prenez une plaque multipuits avec du lysat de cellules bactériennes contenant des protéines solubles. Ces protéines sont dérivées de différents clones bactériens exprimant des ORF individuels - cadres de lecture ouverts - dans le génome, garantissant que chaque puits possède une protéine distincte.

Ajouter un mélange de guanosine tétraphosphate et de pentaphosphate (NSM marqués au phosphore radioactif). Ces molécules se lient aux protéines cibles du lysat. À l’aide d’un outil à goupille, prélevez une quantité égale de liquide dans chaque puits. Placez l’outil sur une membrane de nitrocellulose pour déposer le liquide sous forme de taches.

Les protéines cibles se lient à la membrane par des interactions non covalentes empêchant leur diffusion. Cela séquestre les NSM radiomarqués liés au point central d’application. Les NSM libres diffusent radialement avec la phase liquide par capillarité.

Utilisez l’imagerie au phosphore pour détecter les signaux radioactifs et obtenir une image numérique des taches. Définissez les taches à l’aide de deux cercles. La partie extérieure représente la périphérie des NSM diffus. Le cercle intérieur représente les NSM séquestrés.

Calculez la fraction de liaison, c’est-à-dire l’intensité de la radioactivité détectée dans le cercle intérieur sur la radioactivité totale de la tache diffuse. Localisez les points avec des fractions de liaison élevées pour identifier les puits avec des protéines cibles liées à la NSM.

Pour le criblage DRaCALA des protéines cibles, ajoutez 20 microlitres de lysats de cellules entières décongelés dans des puits individuels d’une plaque de microtitration à fond en V de 96 puits, et ajoutez 2,5 unités d’endonucléase Serratia marcescens dans chaque puits. Après 15 minutes à 37 degrés Celsius, placez les lysats sur de la glace pendant 20 minutes.

Ensuite, mélangez des volumes égaux de guanosine pentaphosphate et de tétraphosphate de guanosine marqués au phosphore 32, et ajoutez 1x tampon de lyse #1 au mélange pour obtenir une solution de guanosine pentaphosphate de quatre nanomolaires.

À l’aide d’une pipette multicanaux et d’embouts de pipette filtrés, mélangez 10 microlitres du mélange de pentaphosphate de guanosine avec le lysat cellulaire pour une incubation de cinq minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, laver trois fois un outil à goupille 96X dans une solution à 0,01 % de détergent non ionique pendant 30 secondes, puis 30 secondes de séchage sur une serviette en papier par lavage, avant de placer l’outil à goupille dans la plaque d’échantillonnage à 96 puits. Après 30 secondes, soulevez l’outil à goupille vers le haut et placez-le directement vers le bas sur une membrane de nitrocellulose pendant 30 secondes.

Après cinq minutes de séchage, placez la membrane de nitrocellulose dans le dossier en plastique transparent pour l’exposition à l’écran de phosphore de stockage et la visualisation par imagerie au phosphore, comme démontré.

Pour quantifier et identifier les protéines cibles potentielles dans le logiciel d’analyse associé à l’imageur phosphore, ouvrez le fichier .gel des plaques visualisées.

Pour définir les spots à analyser, utilisez la fonction « Analyse en réseau » pour mettre en place une grille de 12 colonnes sur 8 rangs. Pour circonscrire le bord extérieur de l’ensemble des taches, définissez de grands cercles. Exportez le « Volumn+Background » et la « Area » des grands cercles définis dans une feuille de calcul, afin de circonscrire les petits points intérieurs. Réduisez la taille des cercles définis.

Exportez le « Volumn+Background » et la « Area » des petits cercles définis et enregistrez toutes les données dans la feuille de calcul. Positionnez les cercles de manière à ce qu’ils se chevauchent avec les points si nécessaire, en les redimensionnant légèrement plus grands que les points réels.

Utilisez l’équation pour calculer les fractions de liaison dans la feuille de calcul et tracez les données. Ensuite, identifiez les protéines de liaison potentielles dans les puits qui présentent des fractions de liaison élevées par rapport à la majorité des autres puits.