Action capillaire radiale différentielle du dosage du ligand : une technique à haut débit pour identifier les protéines intracellulaires de liaison au second messager du nucléotide bactérien

Les bactéries produisent des seconds messagers nucléotidiques, les NSM - molécules de signalisation intracellulaire - en réponse à des stimuli appropriés. Ces molécules se lient aux protéines cibles et régulent les fonctions bactériennes.

Pour identifier ces protéines cibles à l’aide de l’action capillaire radiale différentielle du dosage des ligands, prenez une plaque multipuits avec du lysat de cellules bactériennes contenant des protéines solubles. Ces protéines sont dérivées de différents clones bactériens exprimant des ORF individuels - cadres de lecture ouverts - dans le génome, garantissant que chaque puits possède une protéine distincte.

Ajouter un mélange de guanosine tétraphosphate et de pentaphosphate (NSM marqués au phosphore radioactif). Ces molécules se lient aux protéines cibles du lysat. À l’aide d’un outil à goupille, prélevez une quantité égale de liquide dans chaque puits. Placez l’outil sur une membrane de nitrocellulose pour déposer le liquide sous forme de taches.

Les protéines cibles se lient à la membrane par des interactions non covalentes empêchant leur diffusion. Cela séquestre les NSM radiomarqués liés au point central d’application. Les NSM libres diffu