Dosage de l’activité récepteur-rapporteur d’œstrogène pour cribler l’activité œstrogénique des phytoestrogènes

Les œstrogènes sont des hormones stéroïdes qui agissent comme des molécules de signalisation endocrinienne et se lient aux récepteurs nucléaires - les récepteurs bêta des œstrogènes, formant des complexes de récepteurs œstrogènes-bêta.

Ces complexes ligand-récepteur se dimérisent et forment des homodimères dans le cytoplasme cellulaire. L’homodimère résultant pénètre dans le noyau, se lie à l’élément de réponse aux œstrogènes, ERE – une séquence d’ADN spécifique au sein du promoteur du gène cible – et initie la transcription.

Pour déterminer l’activité œstrogénique des phytoestrogènes – des métabolites secondaires d’origine végétale qui imitent la fonction des œstrogènes – commencez par une plaque multipuits contenant des cellules rapporteures en suspension dans un milieu approprié.

Les cellules rapporteures sont conçues pour surexprimer les récepteurs bêta des œstrogènes et transfectées avec un gène de la luciférase fusionné au promoteur ERE. Ajouter la solution d’échantillon contenant des phytoestrogènes et incuber.

Pendant l’incubation, le phytoœstrogène se lie aux récepteurs d’œstrogènes, bêta, exprimés dans les cellules rapporteures. Une fois liés, les complexes phytoestrogène-récepteur se dimérisent et se déplacent dans le noyau.

À l’intérieur du noyau, le complexe dimérisé se lie à l’ERE. La liaison initie la transcription du gène de la luciférase, produisant l’enzyme luciférase. Ensuite, retirez le milieu et ajoutez un réactif contenant un substrat pour la luciférase. Incuber pour permettre à l’enzyme luciférase exprimée d’oxyder son substrat et de produire de la luminescence.

Mesurez la luminescence, ce qui confirme l’activité œstrogénique du composé dans l’échantillon.

Vortex les échantillons. Ensuite, ajoutez 4 microlitres de chaque échantillon à 496 microlitres de milieu de criblage composé, pour obtenir une solution de DMSO à 0,8 %.

Désinfectez la surface extérieure d’un tube de milieu de récupération de cellules préchauffé avec de l’éthanol à 70 % et transférez 10 millilitres de milieu dans un tube de cellules rapporteures congelées pour les décongeler. Fermez le tube des cellules rapporteures et placez-le dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 5 à 10 minutes.

Après avoir récupéré les cellules du bain-marie, retournez doucement le tube plusieurs fois pour briser les agrégats de cellules et produire une suspension homogène. Ensuite, nettoyez la surface du tube avec de l’éthanol à 70 %.

À l’aide d’une pipette multicanaux, 100 microlitres de suspension de cellule rapporteure dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ensuite, distribuez 100 microlitres d’échantillons en trois exemplaires dans les puits appropriés. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 22 à 24 heures.

Juste avant la fin de l’incubation de la plaque, retirez le substrat de détection et le tampon de détection du réfrigérateur et placez-les dans un endroit peu éclairé jusqu’à ce qu’ils soient équilibrés à la température ambiante. Ensuite, retournez doucement chaque tube pour mélanger les solutions.

Immédiatement avant la fin de l’incubation de la plaque, versez tout le contenu du tampon de détection dans le tube de substrat de détection, afin de créer un réactif de détection de luciférase. Mélangez doucement le tube, afin de ne pas produire de mousse.

Jetez le contenu de la plaque d’échantillon dans un récipient à déchets approprié et tapotez-le doucement sur une serviette en papier absorbante propre pour éliminer les dernières gouttelettes des puits. Ajoutez 100 microlitres de réactif de détection de luciférase dans chaque puits et laissez reposer la plaque de test à température ambiante pendant 15 minutes. Ensuite, quantifiez la luminescence à l’aide d’un luminomètre à lecture de plaque à 96 puits.