Dosage basé sur la luminescence pour évaluer la neurotoxicité des composés testés sur les neurones

L’excroissance des neurites – où les neurones développent des projections – est cruciale pour la fonction neuronale et la régénération.

Pour évaluer in vitro les effets neurotoxiques des composés d’essai favorisant l’excroissance des neurites, obtenir une suspension de cellules progénitrices neurales humaines, hNPC, dans un milieu de différenciation.

Ensemencez les cellules dans des puits à plaques multi-puits recouverts de poly-L-lysine et de laminine, facilitant l’attachement des cellules au fond du puits et favorisant la croissance cellulaire. Les constituants des milieux de différenciation favorisent la différenciation des hNPC en neurones.

Traitez un ensemble de puits avec un composé d’essai favorisant l’excroissance des neurites. Cela interagit avec les neurones dérivés de hNPC et peut induire la croissance des neurites, sans perturber les processus métaboliques cellulaires et la concentration ultérieure d’adénosine triphosphate, ATP - la principale source d’énergie cellulaire.

Ajoutez le réactif en une seule étape contenant des détergents, l’enzyme luciférase et le substrat de la luciférase, la luciférine et les inhibiteurs de l’ATPase ainsi que des ions magnésium, et mélangez.

Les détergents perturbent la membrane cellulaire, ce qui entraîne une lyse cellulaire et une libération intracellulaire d’ATP dans la solution. Les inhibiteurs de l’ATPase inhibent l’ATPase endogène libérée, ce qui peut interférer avec la mesure de l’ATP. Centrifugeuse, sédimentation des débris cellulaires.

Au cours de l’incubation, l’ATP libéré avec des ions magnésium provoque la liaison de la luciférine à la luciférase, ce qui entraîne l’oxydation de la luciférine en oxyluciférine hautement excitée, émettant un photon bioluminescent lors de la relaxation à son état fondamental. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez la luminescence, indicative de la concentration en ATP.

Une concentration plus élevée d’ATP représente une plus grande viabilité cellulaire, ce qui suggère qu’il n’y a pas de toxicité significative du composé d’essai sur les neurones.

Pour enrober la plaque, ajoutez 30 microlitres de poly-L-lysine dans chaque puits d’une plaque de 384 puits et incubez la plaque à température ambiante pendant 1 heure. Lavez-le deux fois avec du PBS et laissez-le sécher pendant environ 30 minutes.

Ajoutez 30 microlitres de laminine dans chaque puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 2 heures. Répétez les lavages avec du PBS et procédez au placage des cellules. Ajoutez 20 000 neurosphères unicellulaires dans 25 microlitres de milieux de différenciation, à chaque puits de la plaque de 384 puits, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant 5 jours.

Des compétences de pipetage de haute précision sont nécessaires pour plaquer le nombre exact de neurosphères qui sont désagrégées en cellules uniques. Par conséquent, il est recommandé de différencier les neurosphères en neurones, avant le placage pour obtenir des résultats plus reproductibles.

Après l’incubation, ajoutez 5 microlitres de composé d’essai dans chaque puits à 6 fois la concentration souhaitée, et incubez les cellules pendant encore 24 heures.

Pour effectuer le test de viabilité cellulaire, ajoutez 30 microlitres de réactif luminescent dans chaque puits et laissez la plaque sur un agitateur pendant 2 minutes. Centrifugez la plaque à 300 à 400 fois g pendant 30 secondes. Ensuite, incubez la plaque à température ambiante pendant 10 minutes, à l’abri de la lumière. Après l’incubation, mesurez la luminescence sur un lecteur de microplaques.