Dosage par transfert de points pour quantifier le génome viral

Pour quantifier l’ADN viral à l’aide du test dot blot, commencez par une suspension d’ADN viral isolée. Traiter avec une solution alcaline pour dénaturer l’ADN double brin en simple brin pour une hybridation ultérieure.

Assemblez l’appareil de transfert de points avec une membrane en nylon pré-humidifiée. Chargez des solutions d’ADN viral dénaturé et d’ADN plasmidique standard linéarisé dans les puits. Appliquez un vide approprié, facilitant le transfert efficace d’ADN monocaténaire viral chargé négativement et la liaison sur la surface de la membrane chargée positivement par des interactions électrostatiques, formant des motifs de points.

Après l’essai, lavez la membrane avec un tampon de citrate de sodium, ce qui aide à améliorer la sensibilité du dosage. Après le séchage, exposez la membrane à la lumière ultraviolette, en réticulant l’ADN tamponné à la membrane.

Ajouter à la membrane un fragment d’ADN non hétérologue dénaturé par la chaleur et une suspension de sonde d’ADN radioactif marquée au phosphore radioactif spécifique au génome viral dans un tampon d’hybridation. Incuber, facilitant l’hybridation.

Les fragments d’ADN agissent comme des agents bloquants, se liant aux régi