Dosage par transfert de points pour quantifier le génome viral

Pour quantifier l’ADN viral à l’aide du test dot blot, commencez par une suspension d’ADN viral isolée. Traiter avec une solution alcaline pour dénaturer l’ADN double brin en simple brin pour une hybridation ultérieure.

Assemblez l’appareil de transfert de points avec une membrane en nylon pré-humidifiée. Chargez des solutions d’ADN viral dénaturé et d’ADN plasmidique standard linéarisé dans les puits. Appliquez un vide approprié, facilitant le transfert efficace d’ADN monocaténaire viral chargé négativement et la liaison sur la surface de la membrane chargée positivement par des interactions électrostatiques, formant des motifs de points.

Après l’essai, lavez la membrane avec un tampon de citrate de sodium, ce qui aide à améliorer la sensibilité du dosage. Après le séchage, exposez la membrane à la lumière ultraviolette, en réticulant l’ADN tamponné à la membrane.

Ajouter à la membrane un fragment d’ADN non hétérologue dénaturé par la chaleur et une suspension de sonde d’ADN radioactif marquée au phosphore radioactif spécifique au génome viral dans un tampon d’hybridation. Incuber, facilitant l’hybridation.

Les fragments d’ADN agissent comme des agents bloquants, se liant aux régions membranaires restantes, minimisant ainsi la liaison non spécifique de la sonde. La sonde radioactive s’hybride avec la séquence complémentaire sur l’ADN viral simple brin.

Laver avec un tampon de lavage pour éliminer les sondes non hybridées. À l’aide du système de balayage d’images au phosphore, quantifiez les signaux radioactifs émis par les sondes radioactives hybridées avec le génome viral sur la membrane, afin d’obtenir des signaux de transfert de points.

À partir de la courbe standard, l’intensité du signal de chaque point sur la membrane peut être utilisée pour calculer la quantité d’ADN viral dans l’échantillon.

Pour effectuer le test de transfert de point, préparez des étalons d’ADN plasmidique en diluant l’ADN plasmidique du génome du vecteur AAV à 10 nanogrammes par microlitre dans de l’eau ou un tampon Tris-HCl. Transférez une aliquote de 25 microlitres de l’ADN plasmidique dilué dans un tube frais et linéarisez-la avec une enzyme de restriction appropriée dans un volume de réaction de 50 microlitres pendant une heure.

Ajoutez 450 microlitres d’eau ou de TE dans le tube contenant l’étalon d’ADN plasmidique digéré et mélangez soigneusement. Ensuite, transférez 70 microlitres de ce mélange dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec 1 330 microlitres d’eau ou d’ET pour fabriquer un étalon plasmidique dilué.

Pour mettre en place l’appareil de transfert de points, à l’aide de ciseaux, coupez la membrane de transfert à une taille appropriée pour le nombre d’échantillons et d’étalons. Trempez la membrane dans de l’eau pendant 10 minutes, avant de la placer sur l’appareil à tamponnage. Ensuite, couvrez les puits inutilisés. Ajouter de l’eau aux puits dans lesquels les échantillons seront chargés. Appliquez un aspirateur, tirez l’eau à travers les puits, vérifiez les erreurs, puis resserrez les vis. Refaites le test si nécessaire.

Appliquez 400 microlitres de chaque étalon d’ADN plasmidique dilué dans chaque puits et effectuez quatre voies de dilutions standard. Utilisez deux aliquotes distinctes de la synthèse standard et chargez-les en double. Ensuite, appliquez 200 microlitres par puits de chaque échantillon d’ADN viral. Appliquez un léger vide pour regrouper les solutions d’ADN à travers les puits. Ensuite, une fois tous les puits vidés, libérez le vide en ajustant la vanne à trois voies.

Ajoutez 400 microlitres de solution alcaline 1X dans chaque puits. Ensuite, attendez cinq minutes avant d’appliquer à nouveau le vide pour vider les puits. Réappliquez l’aspirateur et démontez l’appareil à tamponnage. Ensuite, retirez la membrane et rincez-la avec 2X SSC.

Placez la membrane sur une serviette en papier propre, avec le côté lié à l’ADN vers le haut, pour éliminer l’excès de tampon. Utilisez un réticulant UV approprié pour réticuler l’ADN tamponné à la membrane. La membrane est maintenant prête pour l’hybridation.

Placez la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté lié à l’ADN vers le haut. Rincez la membrane avec 5 à 10 millilitres de tampon d’hybridation préchauffé et jetez le tampon. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de tampon d’hybridation préchauffé et placez la bouteille dans un four d’hybridation rotatif réglé à 65 degrés Celsius. Faites pivoter la bouteille pendant au moins cinq minutes.

Ajoutez rapidement l’ADN du spermatozoïde dénaturé et la sonde radioactive au tampon d’hybridation dans la bouteille et secouez-le pendant 10 secondes pour mélanger. Remettez la bouteille dans le four à 65 degrés Celsius et incubez-la avec une rotation à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures.

Une fois l’hybridation terminée, arrêtez la rotation, retirez le flacon d’hybridation, puis versez la solution de sonde radioactive dans un tube conique de 50 millilitres avec un bouchon étanche. Pour laver la membrane, ajoutez 20 à 30 microlitres de tampon de lavage préchauffé dans la bouteille d’hybridation et faites-la pivoter pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois de plus.

Après le troisième lavage, retirez la membrane de la bouteille d’hybridation et, à l’aide d’essuie-tout, retirez l’excédent de tampon de la membrane. Ensuite, placez la membrane dans un porte-papier en plastique transparent. À l’aide d’un compteur Geiger, vérifiez les signaux radioactifs sur la membrane.

[TRILLING]

Après avoir exposé l’écran d’imagerie au phosphore effacé à la membrane, balayez l’écran à l’aide d’un système de balayage d’image au phosphore et obtenez les données sur l’intensité du signal de chaque point.