Dosage de l’immunoprécipitation pour étudier les interactions entre les récepteurs enzymatiques dans les cellules transfectées
Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
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La mort programmée-1,-1, une protéine réceptrice de surface cellulaire, contient deux motifs cytoplasmiques de tyrosine : le motif inhibiteur, ITIM, et le motif de commutation, ITSM. La liaison du ligand induit la phosphorylation d’ITIM et d’ITSM et le recrutement de la protéine SHP2 de la protéine tyrosine phosphatase dans le domaine cytoplasmique de-1, déclenchant une cascade de signalisation en aval.
Pour étudier les interactions SHP2--1 via un test de co-immunoprécipitation, obtenez une culture de cellules épithéliales adhérentes. Ces cellules expriment une protéine fluorescente verte, une protéine de type sauvage marquée à la GFP avec ITIM et ITSM phosphorylés. Obtenir des cellules épithéliales exprimant le mutant-1 marqué GFP, dans lequel les mutations ITIM ou ITSM inhibent leur phosphorylation.
Ajouter un tampon de lyse contenant un détergent et de l’orthovanadate de sodium. Les détergents lysent les cellules, provoquant la libération de la protéine-1 marquée à la GFP. L’orthovanadate de sodium bloque les phosphatases libérées, empêchant ainsi l’ITIM et la déphosphorylation de l’ITSM.
Centrifuger le lysat. Transférez le surnageant contenant des protéines dans des tubes frais
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