Dosage de l’immunoprécipitation pour étudier les interactions entre les récepteurs enzymatiques dans les cellules transfectées

La mort programmée-1,-1, une protéine réceptrice de surface cellulaire, contient deux motifs cytoplasmiques de tyrosine : le motif inhibiteur, ITIM, et le motif de commutation, ITSM. La liaison du ligand induit la phosphorylation d’ITIM et d’ITSM et le recrutement de la protéine SHP2 de la protéine tyrosine phosphatase dans le domaine cytoplasmique de-1, déclenchant une cascade de signalisation en aval.

Pour étudier les interactions SHP2--1 via un test de co-immunoprécipitation, obtenez une culture de cellules épithéliales adhérentes. Ces cellules expriment une protéine fluorescente verte, une protéine de type sauvage marquée à la GFP avec ITIM et ITSM phosphorylés. Obtenir des cellules épithéliales exprimant le mutant-1 marqué GFP, dans lequel les mutations ITIM ou ITSM inhibent leur phosphorylation.

Ajouter un tampon de lyse contenant un détergent et de l’orthovanadate de sodium. Les détergents lysent les cellules, provoquant la libération de la protéine-1 marquée à la GFP. L’orthovanadate de sodium bloque les phosphatases libérées, empêchant ainsi l’ITIM et la déphosphorylation de l’ITSM.

Centrifuger le lysat. Transférez le surnageant contenant des protéines dans des tubes frais. Ajouter des billes d’agarose enrobées d’anticorps anti-GFP. Les protéines-1 marquées à la GFP se lient aux anticorps anti-GFP.

Incuber avec la suspension SHP2. Le-1-GFP lié aux billes se lie à SHP2 via l’ITIM et l’ITSM phosphorylés.

Ajoutez le tampon Laemmli et faites bouillir afin que les agents réducteurs et les détergents contenus dans le tampon dénaturent les complexes protéiques-1-GFP-SHP2. Centrifuger et recueillir le surnageant contenant les complexes protéiques dénaturés. Effectuez SDS-PAGE et western blot.

-1, de type sauvage et muté par ITIM, interagit avec SHP2. Les mutants ITSM ne parviennent pas à se lier à SHP2, ce qui indique que l’interaction PD1-SHP2 nécessite un ITSM phosphorylé.

Lors de l’immunoprécipitation, toutes les étapes doivent être effectuées soit sur de la glace, soit à 4 degrés Celsius. Complétez le tampon de lyse avec des inhibiteurs de protéase en dissolvant un comprimé d’inhibiteurs dans 10 millilitres de tampon. Ajoutez également 1 millimolaire d’orthovanadate de sodium au tampon qui sera utilisé sur les plaques transfectées PD1-GFP. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lyse glacé aux cellules, en vous assurant d’ajouter le tampon de lyse contenant l’orthovanadate de sodium uniquement aux plaques contenant des cellules transfectées PD1-GFP.

À l’aide d’un grattoir à cellules, vous pourrez immédiatement retirer et recueillir les cellules des plaques. Transférez les lysats dans des tubes froids de 1,5 millilitre et faites-les pivoter à 0,005 fois g et à 4 degrés Celsius pendant 30 minutes. Pour collecter les post-noyaux surnageants des lysats, faites-les tourner à 10 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 10 minutes.

Transférez les surnageants dans de nouveaux tubes et jetez la pastille. Stockez les surnageants pour le deuxième ensemble de six plaques sur de la glace, pour une analyse ultérieure de la WCL.

Pour commencer à préparer des billes anti-GFP, secouez doucement le flacon contenant les billes avant de l’ouvrir pour éviter qu’elles ne se déposent. Retirez 40 microlitres de billes anti-GFP de la boue pour chaque condition. Centrifuger à 500 fois g et 4 degrés Celsius pendant 3 minutes. Retirez le surnageant pour laver les billes, en veillant à minimiser le contact entre la pipette et les billes pour éviter les pertes.

Remettre les billes en suspension dans 80 microlitres de tampon de lyse par échantillon. Ajoutez les billes lavées directement dans le lysat cellulaire à partir des cellules exprimant PD1-GFP du premier ensemble de quatre plaques. Tournez à 0,005 fois g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius pour immunoprécipiter les protéines marquées GFP. Lavez les billes trois fois à l’aide de 1 millilitre de tampon de lyse à froid qui ne contient pas d’orthovanadate pour chaque lavage. Ensuite, centrifugez à 2 500 fois g pendant 10 secondes.

Divisez le lysat de SHP2 actif du premier ensemble de plaques en trois portions égales et ajoutez une portion à chacun des trois tubes contenant les billes lavées contenant PD1-GFP. Ajoutez 1/3 du volume de lysat des cellules non transfectées dans le deuxième tube des billes de PD1-GFP de type sauvage. Jetez les 2/3 restants.

Incuber les billes pendant 4 heures à 4 degrés Celsius avec une rotation douce à 0,005 fois g. Après cela, lavez les billes deux fois, en utilisant 1 millilitre de tampon de lyse froide pour chaque lavage. Ajoutez 80 microlitres de tampon de lyse à chaque échantillon, en veillant à ce que le volume total dans chaque tube soit de 100 microlitres. À l’aide d’une pointe de pipette coupée, pipetez doucement de haut en bas pour mélanger. Ensuite, transférez 50 microlitres de chaque tube dans deux tubes frais de 1,5 millilitre.

Tout d’abord, faites tourner les perles à 2 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 30 secondes et retirez le surnageant. Ajoutez 20 microlitres de 2 tampons Laemmli et faites bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide d’un kit BCA, mesurez la concentration en protéines des témoins d’entrée.

Transférez 30 microlitres de l’échantillon le plus dilué dans un nouveau tube. Utilisez un tampon de lyse pour diluer le reste des commandes d’entrée à la même concentration que l’échantillon le plus dilué. Ensuite, transférez 30 microlitres de chacune des commandes d’entrée diluées dans un nouveau tube. Ajoutez des volumes égaux de 2 tampons Laemmli aux lysats et faites-les bouillir à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Après cela, faites tourner les billes à 2 000 fois g et 4 degrés Celsius pendant 30 secondes avant d’effectuer l’analyse par transfert Western comme indiqué dans le protocole de texte.