Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines

La spectroscopie de fluctuation de fluorescence permet de déterminer l’état d’oligomérisation des protéines d’un échantillon.

Pour commencer, prenez une lame chambrée contenant une solution de monomère protéique marquée par fluorescence. Placez la lame sous un microscope confocal. Focalisez le faisceau laser sur une petite partie de l’échantillon – le volume confocal – pour exciter les monomères protéiques.

Les molécules de protéines diffusent à l’intérieur et à l’extérieur du volume confocal en raison du mouvement brownien. Ce mouvement provoque des changements rapides de l’intensité de la fluorescence, entraînant des fluctuations de l’intensité de la fluorescence au fil du temps.

Ajoutez l’agent dimérisant - un ligand bivalent qui aide deux monomères protéiques à se lier et, ainsi, à former un dimère. En raison de la dimérisation, deux marqueurs fluorescents se rejoignent pour former une seule particule, ce qui augmente l’intensité de fluorescence par particule - la luminosité moléculaire.

L’augmentation de la luminosité moléculaire due à la dimérisation augmente l’amplitude des fluctuations de fluorescence - lorsque deux marqueurs fluorescents entrent et sortent ensemble du volume confocal.

Obtenez des images du volume confocal au fil du temps avant et après l’ajout de l’agent dimérisant.

Calculez la luminosité des pixels individuels dans les images confocales et obtenez la courbe de luminosité moyenne au fil du temps.

L’ajout de l’agent dimérisant entraîne une augmentation deux fois plus importante de la luminosité en raison des signaux de fluorescence doubles de chaque particule, tandis que le nombre total de molécules de protéines reste le même, ce qui indique la formation de dimères.

Pour mettre en place le réseau de plaques multipuits, il faut d’abord préparer une solution de 100 nanomolaires purifiés de FKBP12 dans le même tampon que celui utilisé pour la chromatographie d’exclusion stérique. Sonicate et centrifugeuse avec une rotation rapide de 13 000 tr/min pour éviter la formation d’agrégats.

Maintenant, pipetez 100 à 200 microlitres de la protéine diluée dans une chambre d’observation à 8 puits avec un fond en verre. Ajoutez le dimériseur BB à des concentrations finales de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 et 500 nanomolaires. À titre de référence, préparer une solution de 100 nanomolaires de Vénus seule pour évaluer les effets potentiels d’agrégation et de précipitation, et pour récupérer une valeur de luminosité pour le monomère avec les mêmes paramètres d’acquisition.

Tout système confocal de microscope à balayage de lumière équipé de détecteurs numériques ou de détecteurs analogiques bien caractérisés, et capable de maintenir un temps de séjour constant pour chaque pixel acquis peut être utilisé. Sélectionnez l’objectif de correction à immersion dans l’eau conçu pour la spectroscopie de corrélation de fluorescence.

Ajoutez maintenant une goutte d’eau à l’objectif d’immersion dans l’eau de correction du collier. Montez la chambre d’observation à 8 puits dans la scène. Réglez la trajectoire du faisceau d’excitation en allumant le laser de 514 nanomètres et en le réglant sur une puissance de 20 à 100 nanowatts à la sortie de l’objectif. Allumez un détecteur HyD. Les détecteurs capables de compter les photons sont préférables. Sélectionnez la fenêtre d’émission de 520 à 560 nanomètres.

Pour le mode d’acquisition, utilisez 16 x 16 pixels.

Définissez le temps de séjour des pixels de sorte que le temps d’image soit plus long que la diffusion des protéines et que le temps de séjour des pixels soit beaucoup plus court. Cela correspondait au réglage du temps d’arrêt à environ 13 microsecondes pour le système utilisé dans cette démonstration.

Réglez le sténopé sur une unité Airy pour l’émission correspondante d’environ 545 nanomètres. Sélectionnez le mode d’acquisition en temps xy et sélectionnez le nombre d’images à acquérir par acquisition et bien. Maintenant, réglez la taille du pixel à environ 120 nanomètres.

Si le système est équipé du mode haut débit, introduisez les coordonnées de chaque puits, et le nombre d’acquisitions par puits pour automatiser le processus. Si le système est équipé d’un système de perfusion, chargez la solution BB et programmez la perfusion pour qu’elle commence juste après la 5 000e image afin d’évaluer la cinétique de dimérisation tout en acquérant 10 000 images.

Sélectionnez le puits approprié et concentrez-vous sur la solution. Ensuite, lancez l’acquisition et enregistrez la pile d’images résultante au format TIFF.