Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence

Pour la détection de l’interaction protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence, commencez par des protéines cibles recombinantes marquées avec des motifs de tétracystéine C-terminale dans un tampon d’anisotropie approprié.

Ajoutez un colorant contenant un fluorophore - se liant aux protéines cibles via le motif tétracystéine. Dialyser avec le tampon d’anisotropie, en éliminant le colorant non lié. Transférez le mélange dans des cuvettes en quartz. Mesurez l’absorbance, en déterminant le pourcentage de protéines cibles marquées avec succès.

Dans une cuvette de fluorescence, mélangez les protéines cibles marquées au fluorophore avec des protéines non marquées. À l’aide d’un spectrofluorimètre, mesurez l’anisotropie de fluorescence.

Lorsque les protéines cibles sont suspendues librement dans le tampon, les fluorophores qui leur sont attachés tournent de manière aléatoire autour de leurs axes en raison du mouvement brownien. Lors de l’excitation avec une lumière polarisée verticalement d’une longueur d’onde appropriée, les fluorophores émettent de la lumière polarisée dans les plans vertical et horizontal. Le rapport des intensités de fluorescence des émissions polarisées verticalement et horizontalement (anisotropie) est mesuré.

Lorsque des protéines non marquées se lient aux cibles marquées au fluorophore, la taille moléculaire du complexe protéique augmente, réduisant ainsi son mouvement de rotation. En conséquence, la lumière émise devient plus polarisée, avec une émission plus élevée dans le plan vertical que dans le plan horizontal, ce qui augmente l’anisotropie.

Ajoutez des concentrations croissantes de la protéine non marquée et répétez la mesure de l’anisotropie.

Une augmentation non linéaire de l’anisotropie avec augmentation de l’ajout de protéines non marquées indique une liaison aux protéines non marquées à plusieurs sites de liaison non identiques sur les protéines cibles marquées au fluorophore.

Mélangez 3 nanomoles de la protéine SBDS-FlAsH avec 3 nanomoles du colorant Lumio Green dans un volume de 5 microlitres de tampon d’anisotropie. Laissez la réaction se poursuivre pendant 8 heures à 4 degrés Celsius. Après 8 heures, dialysez l’échantillon contre le tampon d’anisotropie pendant la nuit pour éliminer le colorant libre. Mesurez l’absorbance à 280 nanomètres et 508 nanomètres dans un spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette à quartz. Ensuite, utilisez la loi de Lambert-Beer pour quantifier le pourcentage de protéines étiquetées comme décrit dans le protocole textuel.

Avant de mesurer la valeur d’anisotropie, chaque étape de titrage de la protéine-ligand doit être effectuée avec soin, en veillant à ce que l’échantillon entier soit distribué dans la solution et devienne homogène.

Dans une cuvette de fluorescence, placez 200 microlitres de SBDS-FlAsH de 30 nanomolaires dans un tampon d’anisotropie, et titrez 2 microlitres de EFL1 de 30 micromolaires. Mélangez soigneusement et laissez la réaction reposer pendant 3 minutes avant de mesurer l’anisotropie et la valeur de fluorescence. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’un volume total de 40 microlitres d’EFL1 ait été ajouté. Enfin, ajustez les données à un modèle de liaison présumé, comme décrit dans le protocole texte.