Pourquoi l'anisotropie augmente-t-elle lors de la liaison des protéines ?

L'anisotropie augmente lorsque des protéines non marquées se lient à des cibles marquées par un fluorophore, ce qui accroît la taille moléculaire du complexe et réduit le mouvement de rotation. Cela se traduit par une lumière émise plus polarisée verticalement par rapport à la lumière polarisée horizontalement. Ce changement est mesuré sous la forme d'une valeur d'anisotropie plus élevée, indiquant une interaction réussie.

Comment détermine-t-on le pourcentage de protéine marquée ?

Le pourcentage de protéine marquée est quantifié en mesurant l'absorbance à 280 nm et 508 nm à l'aide d'un spectrophotomètre et d'une cuvette en quartz, puis en appliquant la loi de Lambert-Beer. Cette étape assure une normalisation précise des données d'anisotropie par rapport à la fraction de protéines cibles marquées avec succès. Elle est réalisée après dialyse pour éliminer le colorant non lié et ainsi supprimer les interférences dues au fluorophore libre.

Que signifie une augmentation non linéaire de l'anisotropie ?

Une augmentation non linéaire de l'anisotropie avec la concentration croissante de protéine non marquée suggère une liaison à plusieurs sites non identiques sur la cible marquée au fluorophore. Ce profil reflète des affinités de liaison hétérogènes ou des interactions coopératives, plutôt qu'un modèle à site unique. De telles données soutiennent une analyse mécanistique approfondie de la complexité des interactions.

Pourquoi la réplication est-elle importante dans les titrages d'anisotropie ?

La réplication garantit que chaque étape de titrage est homogène et que l'échantillon entier est uniformément mélangé avant la mesure. Un mélange incohérent peut introduire une variabilité dans les lectures d'anisotropie, ce qui complique l'interprétation de la courbe de liaison. Une réplication rigoureuse permet un ajustement fiable des données aux modèles de liaison et assure la comparabilité entre expériences.

Quelle est l'étape analytique qui suit la collecte des données d'anisotropie ?

Après avoir recueilli les valeurs d'anisotropie au cours d'une série de titrage, les données sont ajustées à un modèle de liaison présupposé, comme décrit dans le protocole. Cette étape permet de quantifier l'affinité de liaison, la stœchiométrie et d'éventuelles coopérativités. L'ajustement du modèle transforme les mesures brutes d'anisotropie en informations exploitables pour la validation de cibles et l'optimisation de composés candidats.

Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence

JoVE Encyclopedia of Experiments

Techniques biologiques

0 vues • 3:41 min • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour la détection de l’interaction protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence, commencez par des protéines cibles recombinantes marquées avec des motifs de tétracystéine C-terminale dans un tampon d’anisotropie approprié.

Ajoutez un colorant contenant un fluorophore - se liant aux protéines cibles via le motif tétracystéine. Dialyser avec le tampon d’anisotropie, en éliminant le colorant non lié. Transférez le mélange dans des cuvettes en quartz. Mesurez l’absorbance, en déterminant le pourcentage de protéines cibles marquées avec succès.

Dans une cuvette de fluorescence, mélangez les protéines cibles marquées au fluorophore avec des protéines non marquées. À l’aide d’un spectrofluorimètre, mesurez l’anisotropie de fluorescence.

Lorsque les protéines cibles sont suspendues librement dans le tampon, les fluorophores qui leur sont attachés tournent de manière aléatoire autour de leurs axes en raison du mouvement brownien. Lors de l’excitation avec une lumière polarisée verticalement d’une longueur d’onde appropriée, les fluorophores émettent de la lumière polarisée dans les plans vertical et horizontal. Le rapport des intensités de fluorescence des émissions polarisées verticalement et horizontalement (anisotropie) est mesuré.

Lorsque des protéines non marquées se lient aux cibles marquées au fluorophore, la taille moléculaire du complexe protéique augmente, réduisant ainsi son mouvement de rotation. En conséquence, la lumière émise devient plus polarisée, avec une émission plus élevée dans le plan vertical que dans le plan horizontal, ce qui augmente l’anisotropie.

Ajoutez des concentrations croissantes de la protéine non marquée et répétez la mesure de l’anisotropie.

Une augmentation non linéaire de l’anisotropie avec augmentation de l’ajout de protéines non marquées indique une liaison aux protéines non marquées à plusieurs sites de liaison non identiques sur les protéines cibles marquées au fluorophore.

Mélangez 3 nanomoles de la protéine SBDS-FlAsH avec 3 nanomoles du colorant Lumio Green dans un volume de 5 microlitres de tampon d’anisotropie. Laissez la réaction se poursuivre pendant 8 heures à 4 degrés Celsius. Après 8 heures, dialysez l’échantillon contre le tampon d’anisotropie pendant la nuit pour éliminer le colorant libre. Mesurez l’absorbance à 280 nanomètres et 508 nanomètres dans un spectrophotomètre à l’aide d’une cuvette à quartz. Ensuite, utilisez la loi de Lambert-Beer pour quantifier le pourcentage de protéines étiquetées comme décrit dans le protocole textuel.

Vidéos connexes

0 Vues

Dernière mise à jour : 15 août 2026

Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence

Aperçu

Composantes clés de l'étude

Domaine scientifique

Contexte

Objectif de l'étude

Méthodes utilisées

Résultats principaux

Conclusions

Questions fréquemment posées

Pertinence professionnelle pour l'industrie

Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique

Début de la découverte et validation de la cible

Développement de criblages et de tests

Recherche translationnelle et préclinique

Intégration des pipelines et des flux de travail

Impact opérationnel et organisationnel

Considérations relatives à la mise en œuvre

Foire aux questions en biopharmacie

Information sur la structure à partir d'une seule molécule FRET expériences utilisant la Nano-positionnement Système rapide

Open Source Content Haute Analyse Utilisant automatisé Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Exempt de calibration In Vitro la Quantification des protéines Homo-oligomérisation à l’aide d’instruments commerciaux et Open Source gratuit, logiciel d’analyse de luminosité

Imagerie interactions protéine-protéine In vivo

Spectroscopie de fluctuation de fluorescence pour étudier l’homo-oligomérisation des protéines

Anisotropie de fluorescence pour déterminer l’affinité de liaison entre le facteur de transcription et l’ADN

Détermination des interactions protéine-ligand à l'aide différentielle à balayage Fluorimétrie

Fluorescence anisotropie comme outil pour étudier les interactions protéine-protéine

À l’aide de trois couleurs frette de molécules simples pour étudier la corrélation des Interactions de protéine

Détection de hétérodimérisation des isoformes de protéines à l’aide d’un test in Situ proximité ligature