Détection des interactions protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence

Pour la détection de l’interaction protéine-protéine basée sur l’anisotropie de fluorescence, commencez par des protéines cibles recombinantes marquées avec des motifs de tétracystéine C-terminale dans un tampon d’anisotropie approprié.

Ajoutez un colorant contenant un fluorophore - se liant aux protéines cibles via le motif tétracystéine. Dialyser avec le tampon d’anisotropie, en éliminant le colorant non lié. Transférez le mélange dans des cuvettes en quartz. Mesurez l’absorbance, en déterminant le pourcentage de protéines cibles marquées avec succès.

Dans une cuvette de fluorescence, mélangez les protéines cibles marquées au fluorophore avec des protéines non marquées. À l’aide d’un spectrofluorimètre, mesurez l’anisotropie de fluorescence.

Lorsque les protéines cibles sont suspendues librement dans le tampon, les fluorophores qui leur sont attachés tournent de manière aléatoire autour de leurs axes en raison du mouvement brownien. Lors de l’excitation avec une lumière polarisée verticalement d’une longueur d’onde appropriée, les fluorophores émettent de la lumière polarisée dans les plans vertical et horizontal. Le rapport des intensités de fluorescence des émissions polarisées