Essai modifié levure-un hybride pour détecter les interactions entre le complexe protéique hétéromérique et l’ADN

Pour détecter les interactions entre des complexes protéiques hétéromériques impliquant plusieurs protéines avec l’ADN cible à l’aide du test modifié sur un seul hybride de levure, prenez une plaque multi-puits contenant la concentration souhaitée d’une culture de cellules de levure transformée en croissance active.

Ces cellules contiennent une séquence d’ADN spécifique en amont du gène rapporteur codant pour la β-galactosidase, pilotée par le promoteur GAL-4, alors qu’il n’y a pas la protéine endogène du facteur de transcription GAL-4. Les cellules expriment une protéine cible fusionnée au domaine d’activation GAL-4 et une autre protéine dépourvue du domaine de liaison à l’ADN GAL-4.

Si ces protéines interagissent, elles pourraient former un complexe, permettant à la protéine cible de se lier à la séquence d’ADN en amont dans la région promotrice du gène rapporteur. Le domaine d’activation GAL-4 active l’expression de l’enzyme rapporteure β-galactosidase.

centrifugeuse. Remettez les cellules en suspension dans un tampon approprié. Gelez-décongelez les cellules pour les lyser et libérer de la β-galactosidase. Ajoutez du bêta-mercaptoéthanol et un tampon contenant un substrat de β-g