Encyclopédie des expériences JoVE
Techniques biologiques
0 vues • 4:12 min • July 8th, 2025
Pour détecter les interactions entre des complexes protéiques hétéromériques impliquant plusieurs protéines avec l’ADN cible à l’aide du test modifié sur un seul hybride de levure, prenez une plaque multi-puits contenant la concentration souhaitée d’une culture de cellules de levure transformée en croissance active.
Ces cellules contiennent une séquence d’ADN spécifique en amont du gène rapporteur codant pour la β-galactosidase, pilotée par le promoteur GAL-4, alors qu’il n’y a pas la protéine endogène du facteur de transcription GAL-4. Les cellules expriment une protéine cible fusionnée au domaine d’activation GAL-4 et une autre protéine dépourvue du domaine de liaison à l’ADN GAL-4.
Si ces protéines interagissent, elles pourraient former un complexe, permettant à la protéine cible de se lier à la séquence d’ADN en amont dans la région promotrice du gène rapporteur. Le domaine d’activation GAL-4 active l’expression de l’enzyme rapporteure β-galactosidase.
centrifugeuse. Remettez les cellules en suspension dans un tampon approprié. Gelez-décongelez les cellules pour les lyser et libérer de la β-galactosidase. Ajoutez du bêta-mercaptoéthanol et un tampon contenant un substrat de β-galactosidase.
Le bêta-mercaptoéthanol stabilise l’enzyme β-galactosidase. β-galactosidase hydrolyse le substrat de la β-galactosidase, formant un chromogène jaune.
Ajouter une solution de carbonate de sodium pour dénaturer la β-galactosidase et arrêter la réaction. Centrifugeuse. Transférez le surnageant contenant le chromogène jaune dans une plaque multipuits. À l’aide d’un lecteur de plaques, mesurez la densité optique de la solution à une longueur d’onde appropriée pour calculer l’activité de la β-galactosidase.
Une activité plus élevée de la β-galactosidase indique des interactions positives entre les protéines et la séquence d’ADN cible, ce qui conduit à l’expression de la β-galactosidase.
Remettre la culture en suspension et transférer 125 microlitres de chaque puits sur une plaque de spectrophotomètre. Mesurez la densité optique à 600 nanomètres pour vous assurer qu’elle est comprise entre 0,3 et 0,6. Centrifugez les cellules restantes dans le bloc de puits profond à 3 000 fois g et 21 degrés Celsius pendant 10 minutes. Retirez le surnageant en l’inversant.
Ajoutez 200 microlitres de Z-buffer dans chaque puits et vortex. Centrifuger à 3 000 fois g et 21 degrés Celsius pendant 5 minutes. Retirez le surnageant en l’inversant. Ajoutez 20 microlitres de Z-buffer dans chaque puits et vortex. Recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité résistant aux cycles de gel-dégel.
Dans une hotte, effectuez quatre cycles de congélation-décongélation en utilisant de l’azote liquide dans un bain-marie à 42 degrés Celsius. Ajoutez 200 microlitres de solution Z-buffer/bêta-mercaptoéthanol/ONPG fraîchement préparée dans chaque puits. Incuber à 30 degrés Celsius pendant 17 à 24 heures ou jusqu’à ce que la couleur se développe. Vérifiez que la couleur s’est développée.
Ajoutez 110 microlitres de carbonate de sodium de 1 molaire dans chaque puits pour arrêter la réaction. Notez l’heure et tourbillonnez la plaque. Centrifuger à 3 000 fois g et 21 degrés Celsius pendant 10 minutes. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 125 microlitres de surnageant de chaque puits vers une plaque de spectrophotomètre. Mesurez la densité optique à 420 nanomètres.