Essai de liaison in vitro basé sur SELEX pour identifier les interactions ARN-protéines

L’évolution systématique des ligands par enrichissement exponentiel, SELEX, permet l’identification de séquences d’ARN liant des protéines.

Tout d’abord, obtenir un pool d’ARN randomisé contenant des ARN radiomarqués avec des séquences aléatoires qui se replient en structures hautement spécifiques. Incuber avec la protéine cible. La protéine se lie aux molécules d’ARN avec des séquences spécifiques et des structures tridimensionnelles, tandis que les ARN non spécifiques restent non liés.

Passez le mélange à travers un filtre en nitrocellulose. L’ARN non lié passe à travers les pores du filtre, tandis que les complexes ARN-protéines restent conservés.

Coupez le filtre contenant le complexe ARN-protéine en fragments. Répéter l’interaction ARN-protéine en incubant le pool d’ARN avec une concentration réduite de protéines cibles, ce qui ne permet que la liaison de séquences de haute affinité, tandis que les séquences de faible affinité ne parviennent pas à se lier.

Chargez ce mélange sur un gel de polyacrylamide et effectuez une électrophorèse. Les complexes ARN-protéines migrent lentement à travers le gel par rapport aux ARN non liés de faible affinité. L’imagerie par gel à rayons X montre un décalage de bande correspondant à l’emplacement du complexe ARN-protéine.

Coupez en tranches la portion de gel contenant le complexe. Ajoutez de la protéinase K aux fragments de filtre et aux tranches de gel, digérant les protéines et libérant l’ARN du complexe. Ajouter du phénol-chloroforme et centrifuger, en séparant l’ARN des protéines digérées.

Mélangez le surnageant contenant de l’ARN avec de l’acétate de sodium et de l’éthanol. Centrifugeuse pour précipiter l’ARN. Remettre en suspension dans de l’eau exempte de RNase. Transcrire l’ARN en ADN complémentaire et amplifier l’ADN par PCR.

Répétez plusieurs cycles de séparation à base de filtre et de gel pour obtenir un pool de séquences d’ADN spécifiques à la protéine cible.

Pour lier les protéines et l’ARN dans un volume de réaction de 100 microlitres, préparez d’abord 10 millimolaires de tris-chlorhydrate à pH 7,5, contenant 50 millimolaires de chlorure de potassium, un millimolaire de DTT, 0,09 microgramme par microlitre d’albumine sérique bovine, 0,5 unité par microlitre d’ARNe, 0,15 microgramme par microlitre d’ARNt et 1 millimolaire d’EDTA. Ensuite, ajoutez 30 microlitres de protéine recombinante PTB et 10 microlitres d’ARN du pool approprié.

Placez les tubes contenant les réactions de liaison dans un bloc de température pendant environ 30 minutes à 25 degrés Celsius. Ensuite, fractionnez l’ARN lié de l’ARN non lié à travers quatre cycles de sélection et d’amplification. Tout d’abord, filtrez l’échantillon de 100 microlitres à température ambiante à travers un filtre à nitrocellulose fixé à un collecteur à vide. Le complexe ARN-protéine reste sur le filtre.

Avec une lame de rasoir stérile, coupez le filtre en fragments et insérez-les dans un tube à centrifuger. Plongez les morceaux filtrants dans un tampon de protéinase K et placez-le sur un gobelet pendant au moins trois heures ou toute la nuit pour récupérer l’ARN.

Pour déprotéiniser l’échantillon d’ARN, ajoutez un volume égal de phénol-chloroforme, vortex. Ensuite, centrifugez à grande vitesse pendant cinq minutes à température ambiante. Obtenez la phase aqueuse, et extrayez à nouveau avec du chloroforme. Après cela, mélangez le surnageant avec 1/10e de volume d’acétate de sodium à 3 molaires à pH 5,2 et deux à trois volumes d’éthanol absolu.

Laissez le tube dans un congélateur à -80 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis centrifugez-le à grande vitesse pendant 10 minutes. Répétez les étapes de lavage et de séchage avec de l’éthanol à 70 % et solubilisez l’ARN dans de l’eau traitée au DEPC. Après le premier cycle de test de liaison du filtre, effectuez trois autres cycles.

Ensuite, effectuez deux cycles de transcription, de liaison et d’amplification pour séparer les fractions d’ARN liées aux protéines des fractions non liées. Pré-mouler un gel natif de polyacrylamide à 5 % avec un rapport de 60 à 1 acrylamide bisacrylamide dans un tampon TBE 0,5x. Ensuite, mettez en place la réaction de liaison ARN-protéine.

Placez le gel dans un appareil d’électrophorèse rempli d’un tampon TBE 0,5x dans une pièce froide à 4 degrés Celsius. Appliquez 250 volts pendant 15 minutes et pipetez la réaction de liaison dans différents puits. Ensuite, fractionnez l’ARN lié de l’ARN non lié en exécutant l’électrophorèse à 250 volts pendant une à deux heures.

Ensuite, exposez le gel à un film radiographique et identifiez l’emplacement de l’ARN lié à l’aide de l’autoradiographie. Découpez la tranche de gel avec l’ARN lié et insérez-la dans un tube. Écrasez la tranche de gel et incubez-la dans le tampon de protéinase K pendant trois heures ou toute la nuit. Répétez l’extraction avec du phénol-chloroforme et du chloroforme, comme décrit précédemment. Synthétiser l’ADNc à partir de l’ARN dissous.

Préparez 20 microlitres de réaction, dont deux microlitres de tampon 10x RT, deux microlitres de transcriptase inverse AMV, 1 microlitre d’amorce inverse, 5 microlitres d’eau et 10 microlitres d’ARN dissous. Incuber à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes.

Amplifiez l’ADNc à l’aide de 20 à 25 cycles de PCR comme décrit précédemment. Répétez le processus de synthèse de l’ARN, de liaison aux protéines et de séparation des fractions liées et non liées aux protéines.