Calorimétrie différentielle à balayage pour étudier l’interaction aptamère-ligand thermolabile de l’ADN

La calorimétrie différentielle à balayage permet d’étudier les interactions biomolécule-ligand en mesurant la chaleur nécessaire pour dénaturer la biomolécule en l’absence et en présence du ligand.

Pour commencer, prenez une référence contenant des aptamères d’ADN libres – des oligonucléotides monocaténaires monocaténaires structurés – et un échantillon contenant des aptamères thermolabiles liés à des ligands. Les ligands stabilisent la structure secondaire de l’aptamère.

Effectuez un balayage avant en chauffant les solutions. Lorsqu’ils atteignent la température de fusion, les aptamères libres se dénaturent.

Les aptamères stabilisés par des ligands se dissocient des ligands et se dénaturent à une température relativement plus élevée, provoquant une augmentation de la température de fusion par rapport aux aptamères libres. À haute température, un sous-ensemble de ligands obtient une forme secondaire irréversible avec une faible affinité de liaison.

Ensuite, effectuez un balayage inversé en refroidissant les solutions afin de retrouver la structure de l’aptamère. À basse température, les ligands initiaux et convertis de l’échantillon se lient aux aptamères.

Au cours du deuxième balayage vers l’avant, les aptamères liés avec une faible affinité aux ligands convertis se dissocient et se dénaturent à une température plus basse que les aptamères liés au ligand initial, provoquant une baisse de la température de fusion.

Avec des balayages successifs, les ligands continuent à se convertir en forme secondaire, ce qui entraîne l’épuisement complet de la forme initiale. Munissez-vous du thermogramme.

À chaque balayage, la température de fusion de l’aptamère lié au ligand se déplace vers l’aptamère libre, indiquant la faible affinité de liaison de la forme secondaire.

Dégazez les solutions tampon, biomoléculaires et ligands dans un dégazeur de table avant de les charger dans le calorimètre différentiel à balayage, ou DSC. Dévissez la poignée de pression du DSC. Ensuite, faites passer le tube en silicone à partir du tampon de travail et fixez-le à la bride avant du capillaire de référence.

Créez un pont entre les capillaires de référence et d’échantillon en connectant la bride de référence arrière à la bride d’échantillon avant. Ensuite, fixez un morceau de tube en silicone à la bride d’échantillon arrière qui va vers une fiole à déchets avec une conduite de vide attachée. Allumez la conduite d’aspiration pour rincer le DSC avec 200 millilitres de tampon de travail.

Commencez par fixer des sections d’environ 3 à 5 centimètres de tube en silicone aux brides capillaires de référence. Ensuite, insérez une pointe de pipette de 1 millilitre dans le tube en silicone de la bride arrière. Prélevez 0,8 millilitre de tampon de travail à l’aide d’une pipette et insérez la pointe de la pipette avec le tampon dans le tube en silicone de la bride de référence avant.

Appuyez doucement sur le piston de la pipette pour faire passer le tampon de travail à travers le tube en silicone avant dans le capillaire de référence et vers le haut dans l’embout de pipette fixé à la bride arrière. Appuyez sur le piston de la pipette jusqu’à ce que le niveau du tampon de travail atteigne juste au-dessus du tube en silicone avant. Ensuite, relâchez le piston de la pipette jusqu’à ce que le niveau du tampon de travail atteigne juste au-dessus du tube en silicone arrière. Continuez à faire passer le tampon de travail d’avant en arrière dans le capillaire de référence pour purger le volume des bulles.

Ensuite, bouchez l’embout arrière de la pipette avec l’index et tirez doucement sur l’embout arrière de la pipette et la pipette avant pour les retirer des brides de référence avec le tube en silicone attaché. Chargez le capillaire de l’échantillon avec le tampon de travail comme précédemment.

Placez un capuchon en plastique noir sur la référence arrière et les brides d’échantillonnage, en laissant les brides avant découvertes. Fixez la poignée de pression au DSC, puis ouvrez le logiciel DSC et pressurisez l’instrument en cliquant sur la flèche rouge « Haut » en haut de l’interface une fois que la lecture de puissance s’est stabilisée. La puissance DSC est indiquée dans une case en haut à droite de l’interface, ainsi que la lecture de la température et de la pression de l’instrument.

Équilibrez le DSC avec la mémoire tampon de travail en effectuant un balayage avant et arrière. Dans l’onglet « Méthode expérimentale » sur le côté gauche de l’écran, assurez-vous que l’option « Balayage » est sélectionnée pour exécuter le DSC en mode de balayage de la température.

Dans l’encart « Paramètres de température » sous l’onglet « Méthode expérimentale », cliquez sur le bouton de chauffage. Entrez 1 et 100 degrés Celsius pour les températures expérimentales inférieure et supérieure, 1 degré Celsius par minute pour la vitesse de balayage et 60 secondes pour la période d’équilibre. Cliquez sur le bouton « Ajouter une série » sous le champ de saisie de la période d’équilibrage. Entrez 2 dans le champ « Étapes à ajouter » dans la fenêtre contextuelle et cochez la case « Chauffage/Climatisation alternatif ». Cliquez sur « OK ».

Les numérisations ajoutées apparaissent dans la partie inférieure de l’interface. Vérifiez que les paramètres de chaque balayage sont ceux souhaités. Démarrez l’expérience en cliquant sur le bouton vert « Jouer » en haut de l’interface. Naviguez jusqu’à la fenêtre souhaitée et entrez un nom de fichier pour enregistrer l’expérience dans la fenêtre contextuelle. Affichez la progression de l’expérience en cliquant sur l’onglet « Données » à droite de l’onglet « Méthode de l’expérience ».

Exécutez des expériences de référence pour la soustraction de la ligne de base des données de l’échantillon en rechargeant la DSC avec un tampon de travail dans les deux capillaires. Collectez plusieurs balayages avant et arrière sur une plage de température appropriée à 1 degré Celsius par minute avec un temps d’équilibre supérieur de 120 secondes.

Supprimez les analyses d’équilibrage de la mémoire tampon précédentes de la partie inférieure de l’interface en les mettant en surbrillance individuellement et en cliquant sur le « X » rouge au milieu à droite de l’interface.

Ajoutez les nouveaux numérisages en cliquant sur le bouton « Ajouter une série », en entrant 20 dans le champ « Étapes à ajouter » et en cochant la case « Chauffage/Climatisation alternatif ». Ensuite, cliquez sur « OK » et exécutez l’expérience en cliquant sur le bouton vert « Jouer » comme précédemment.

Répétez ces étapes avec un tampon de travail contenant la concentration souhaitée de ligand dans les deux capillaires pour obtenir les expériences de référence pour le ligand. Rassemblez deux expériences distinctes à utiliser pour acquérir la constante de vitesse pour la conversion de ligands thermolabiles.

Pour l’ensemble de données sur la biomolécule libre, assurez-vous que le capillaire de référence contient le tampon de travail, tandis que le capillaire de l’échantillon contient la biomolécule libre à la concentration souhaitée dans le tampon de travail. Ensuite, exécutez les expériences d’échantillonnage en utilisant la même procédure de chargement DSC et les mêmes paramètres expérimentaux que ceux utilisés dans les balayages de référence.

Pour les expériences liées au ligand, assurez-vous que le ligand se trouve dans le tampon de travail du capillaire de référence et que la biomolécule et le ligand se trouvent dans le tampon de travail du capillaire de l’échantillon. Rincez le système entre les ajouts de différents ligands comme précédemment.

Effectuez une expérience supplémentaire avec la biomolécule liée au ligand thermolabile où la période d’équilibre à haute température est augmentée à 600 secondes, et tous les autres paramètres expérimentaux sont les mêmes qu’auparavant. Procéder au traitement et à l’analyse des données comme décrit dans le protocole texte.