Essai de liaison compétitive pour identifier les composés perturbant les interactions récepteur-ligand

Le test de liaison compétitive identifie de petites molécules qui perturbent les interactions récepteur-ligand en se liant de manière compétitive à un récepteur cible, inhibant ainsi la liaison naturelle des ligands.

Pour identifier les interactions d’un récepteur avec son ligand naturel en présence d’un antagoniste de petites molécules spécifique au récepteur, commencez par une suspension de cellules lymphocytaires T humaines exprimant le récepteur cible.

Ajouter la suspension cellulaire dans les puits d’une plaque multipuits contenant des concentrations croissantes d’antagonistes. Couver. L’antagoniste se lie au site de liaison orthostérique - le site de liaison naturel du ligand du récepteur.

Ajoutez une concentration fixe de ligands naturels marqués par fluorescence dans les puits. Couver.

À de faibles concentrations, les antagonistes occupent peu de sites de liaison orthostériques, permettant la liaison naturelle des ligands aux récepteurs. Cependant, à des concentrations plus élevées, les antagonistes occupent la plupart des sites de liaison orthostériques, permettant une liaison naturelle ligand-récepteur minimale.

Centrifugeuse pour granuler les cellules. Jetez le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans du paraformaldéhyde pour les fixer, en préservant la morphologie cellulaire.

À l’aide d’un cytomètre en flux, analysez les signaux de fluorescence des lymphocytes T individuels exprimant les récepteurs liés aux ligands antagonistes et fluorescents.

Une diminution dose-dépendante de l’intensité moyenne de la fluorescence avec l’augmentation des concentrations d’antagonistes spécifiques du récepteur indique une liaison compétitive des antagonistes aux sites de liaison des récepteurs orthostériques, inhibant l’interaction naturelle ligand-récepteur.

Pour commencer, distribuez 100 microlitres de solution composée dans une plaque à fond rond transparent à 96 puits selon un schéma expérimental prédéfini.

Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire à partir d’un réservoir de réactifs dans la plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Incuber la plaque pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Après l’incubation, ajoutez 50 microlitres de CXCL12 de 100 nanogrammes par millilitre marqués par fluorescence à partir d’un réservoir de réactif similaire dans les puits de la plaque de 96 puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité.

Ensuite, centrifugez la plaque de 96 puits à 400 fois la gravité pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez le surnageant des cellules granulées en retournant la plaque. Séchez l’assiette sur un mouchoir en papier. Ajoutez 200 microlitres de tampon de dosage frais d’un réservoir de réactif dans les puits à l’aide d’une pipette multicanaux.

Procédez immédiatement à la centrifugation de la plaque pendant 5 minutes à 400 fois la gravité à température ambiante. Encore une fois, retirez le surnageant en retournant la plaque, puis en le séchant sur un mouchoir. Enfin, remettez doucement en suspension la pastille cellulaire dans 200 microlitres de paraformaldéhyde à 1 % dissous dans du PBS. Cette étape permettra de réparer les cellules.

Pour analyser les échantillons par cytométrie en flux, démarrez l’appareil et ouvrez le logiciel correspondant. Sélectionnez les paramètres cellulaires à visualiser au format dot-blot comme la zone de diffusion directe, la zone de diffusion latérale et, dans une vue d’histogramme, le canal de détection du fluorophore.

Choisissez un échantillon, par exemple un échantillon de contrôle négatif, pour effectuer le contrôle d’une population cellulaire homogène définie en fonction des paramètres de diffusion directe et de diffusion latérale. Adaptez les paramètres de chargement des cellules dans l’appareil de cytométrie en flux.

Sélectionnez trois mélanges avant l’injection. Sélectionnez l’injection automatique de 100 microlitres de cellules fixées et utilisez un débit d’échantillon de 1,5 microlitre par seconde. Exécutez l’exemple en sélectionnant « Acquérir des données ». Les paramètres de diffusion directe et latérale de cet échantillon ainsi que la détection du fluorophore apparaîtront désormais à l’écran.

Maintenant, sélectionnez l’outil de contrôle du logiciel. Sur la base de la visualisation du graphique dot-blot à diffusion directe et à diffusion latérale, prédéfinissez une population cellulaire homogène et viable par gating. Sélectionnez cette option pour analyser 20 000 « événements » par échantillon.

Cela signifie que pour chaque échantillon, 20 000 cellules qui se trouvent à l’intérieur d’une porte prédéfinie seront finalement analysées. L’acquisition des données se poursuivra jusqu’à ce que ce nombre d’événements soit atteint.

Commencez la course en sélectionnant d’abord les puits à analyser. Ensuite, sélectionnez « Run Wells ».

L’appareil de cytométrie en flux analysera maintenant ces échantillons un par un en enregistrant l’intensité moyenne de fluorescence de chaque échantillon, qui correspond au signal fluorescent moyen des 20 000 cellules qui se trouvent à l’intérieur de la porte prédéfinie.

Enfin, effectuez l’analyse des données comme décrit dans le protocole.