Test de microréseau d’antigène viral pour détecter les isotypes d’anticorps dans le sérum contre l’antigène viral

Commencer le test de micropuce à antigène viral avec une lame de micropuce à antigène viral préparée.

La lame contient plusieurs tampons, chacun avec un seul réseau contenant des centaines d’antigènes purifiés de plusieurs souches virales imprimés sur des points disposés dans une grille. Chaque tache contient un seul type d’antigène adsorbé sur la surface microporeuse tridimensionnelle de nitrocellulose

Fixez la glissière dans une chambre pour une manipulation facile lors des étapes suivantes. Ajoutez un tampon bloquant contenant des protéines qui se lient aux surfaces restantes de la lame pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps à la surface.

Incuber la lame de micropuce avec du sérum humain dilué. Les isotypes d’anticorps dans le sérum, spécifiques des antigènes sur la lame, reconnaissent et se lient aux épitopes des antigènes.

Retirez le sérum. Lavez avec un tampon pour éliminer les anticorps et les protéines non liés sur la lame.

Ajoutez des mélanges d’anticorps secondaires conjugués à des points quantiques, chacun avec un point quantique différent. Les anticorps secondaires spécifiques à l’isotype se lient spécifiquement à l’isotype d’anticorps sérique correspondant lié aux antigènes sur la lame.

Utilisez un imageur de micropuce pour quantifier la liaison des anticorps aux antigènes dans la lame de microréseau.

Lors de l’excitation à des longueurs d’onde appropriées, les points quantiques liés aux anticorps secondaires retournent à l’état fondamental et émettent des signaux fluorescents spécifiques qui sont détectés par le photodétecteur.

L’intensité de la fluorescence ponctuelle quantifie l’isotype de l’anticorps sérique dans le sérum lié à l’antigène individuel.

Après avoir programmé le logiciel d’impression avec le protocole souhaité, démarrez le tirage. Une fois terminé, placez les lames de microréseaux non sondées dans une boîte étanche à la lumière dans une armoire à dessiccateur à température ambiante.

Pour sonder les sérums à la recherche d’anticorps sur la puce à électricité, utilisez des pinces pour fixer les lames de la puce à microréseau, côté coussin vers le haut, sur les chambres de sondage, et placez les chambres dans les cadres.

Soyez prudent lors de l’assemblage des glissières, car elles se cassent facilement, et vérifiez qu’il n’y a pas de fuite après la réhydratation. Si nécessaire, démontez et remontez les glissières pour réparer les fuites.

Réhydratez les lames avec 100 microlitres de tampon de blocage filtré par puits, et diluez le sérum dans un rapport de 1 à 100 dans 100 microlitres de tampon de blocage par échantillon. Ensuite, incubez les lames de micropuces réhydratées et le sérum dilué pendant 30 minutes à température ambiante et 100 à 250 rotations par minute sur un agitateur orbital.

À la fin de l’incubation, utilisez les pointes de pipette reliées à une conduite de vide avec un ballon de collecte secondaire pour aspirer soigneusement le tampon de blocage du coin de chaque chambre sans toucher les tampons, et ajoutez immédiatement le sérum dilué aux tampons sans laisser les tampons sécher. Ensuite, placez les cadres couverts dans des plateaux contenant des serviettes en papier humides scellées pour maintenir l’humidité, et incubez les cadres pendant la nuit à 4 degrés Celsius sur un shaker à bascule.

Pour le marquage d’anticorps secondaires conjugués à des points quantiques, aspirez soigneusement les sérums, comme cela vient d’être démontré, et rincez les lames avec trois lavages dans 100 microlitres de tampon T-TBS frais par puits pendant 5 minutes chacune sur un agitateur orbital. Les lames sont ensuite incubées avec un mélange d’anticorps secondaires conjugués à des points quantiques, puis lavées trois fois comme décrit dans le protocole en utilisant la même technique que celle qui vient d’être démontrée.

Après le dernier lavage, retirez soigneusement les lames des chambres et rincez doucement les lames avec de l’eau filtrée double distillée, puis placez chaque lame dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, séchez les lames par centrifugation.

Pour acquérir des images des lames de la puce à puce, allumez d’abord l’imageur portable et placez soigneusement la lame à imager face cachée dans le support de lame dans la chambre d’imagerie. Ouvrez le logiciel d’imagerie et, sous l’onglet « Configurer l’imageur », sélectionnez la configuration de diapositive appropriée.

Sous l’onglet « Contrôle d’image », sélectionnez le canal fluorescent approprié, et ajustez les temps d’exposition et d’acquisition, en fonction de la réactivité du sérum. Ensuite, cliquez sur « Capturer » pour lancer l’acquisition de l’image. A la fin de l’acquisition, utilisez les grilles orientées sur les repères pour détecter les points du réseau.