Microscopie TIRF pour visualiser la dynamique du couplage de l’actine et des microtubules

Les monomères d’actine polymérisent de la tête à la queue pour former de fines fibres, appelées microfilaments. De même, les dimères de tubuline polymérisent en microtubules cylindriques creux plus longs. Ces composants du cytosquelette maintiennent la forme cellulaire et facilitent la motilité cellulaire.

Pour visualiser la dynamique du couplage actine-microtubule par microscopie à réflexion interne totale, TIRF, prenez un assemblage d’imagerie personnalisé.

L’ensemble d’imagerie se compose de deux lamelles : une lamelle supérieure recouverte de silane m-PEG et une lamelle inférieure recouverte de biotine-PEG silane. Les deux lamelles sont espacées longitudinalement avec du ruban adhésif double face et scellées aux deux extrémités pour créer un canal d’écoulement.

Pipette BSA dans le canal d’écoulement pour amorcer la chambre. Ajouter la solution de streptavidine et incuber. Les molécules de streptavidine se lient aux molécules de biotine attachées au PEG-silane de la lamelle inférieure.

Flux de tampon TIRF dans le canal. Ajoutez une solution de mélange de cytosquelette contenant des dimères de tubuline non marqués et marqués au fluorophore vert, ainsi que des monomères d’actine non marqués, marqués à la biotine et marqués au fluorophore violet.

Ensuite, ajoutez une solution réactionnelle contenant de l’ATP (agent favorisant la polymérisation de l’actine), du GTP (agent favorisant la polymérisation de la tubuline) et de la protéine de couplage actine-microtubule. Couver.

Les dimères de tubuline se lient aux molécules de GTP et polymérisent, tandis que les monomères d’actine se lient aux molécules d’ATP et polymérisent pour former des microtubules et des microfilaments, respectivement.

Placez l’ensemble d’imagerie sous un microscope TIRF. Excitez les fluorophores avec des lasers de longueurs d’onde appropriées.

La lumière d’excitation se réfléchit à l’intérieur et crée un champ lumineux qui éclaire sélectivement les fluorophores dans une région limitée près de l’interface verre-eau, où se trouvent deux milieux avec des indices de réfraction différents. Dans cette région, les microfilaments apparaissent violets et les microtubules apparaissent verts.

Coupez 12 bandes de ruban adhésif double face à double dos, sur une longueur de 24 millimètres. Retirez un côté du support du ruban adhésif et fixez les morceaux de ruban adhésif adjacents aux six rainures présentes sur une chambre d’imagerie propre. Retirez le deuxième morceau de support de ruban adhésif, pour exposer le côté collant du ruban le long de chaque rainure de la chambre, et placez la chambre, côté ruban vers le haut, sur une surface propre.

Mélangez des solutions de résine époxy et de durcisseur, un à un dans un petit bateau de poids, et utilisez une pointe P1000 pour placer une goutte d’époxy mélangé entre les bandes de ruban à l’extrémité de chaque rainure de la chambre d’imagerie. Ensuite, placez du ruban adhésif de chambre, ou côté époxy vers le haut, sur une surface propre.

Retirez une lamelle recouverte de l’incubateur à 70 degrés Celsius et rincez six fois les surfaces revêtues et non revêtues des lamelles avec de l’eau bidistillée. Sécher avec de l’azote gazeux filtré, puis fixer dans la chambre d’imagerie, avec le côté revêtement de lamelle vers le ruban.

Utilisez une pointe de pipette P200 ou P1000 pour appliquer une pression sur l’interface ruban-verre, afin d’assurer une bonne étanchéité entre le ruban et la lamelle. Incuber les chambres assemblées à température ambiante pendant au moins cinq à 10 minutes, pour permettre à l’époxy de sceller complètement les parois de la chambre avant utilisation.

Les chambres de perfusion expirent dans les 12 à 18 heures suivant l’assemblage. Utilisez une pompe de perfusion et échangez séquentiellement les solutions de conditionnement dans la chambre de perfusion en faisant couler 50 microlitres de BSA à 1 % pour amorcer la chambre d’imagerie.

Retirez l’excédent de tampon du réservoir de raccord Luer-lock. Ensuite, faites couler 50 microlitres de 0,005 milligramme par millilitre de streptavidine et incubez pendant une à deux minutes à température ambiante. Retirez l’excédent de tampon du réservoir.

Écoulez 50 microlitres de BSA à 1 % pour bloquer la liaison non spécifique, et incubez pendant 10 à 30 secondes. Retirez l’excédent de tampon du réservoir. Ensuite, versez 50 microlitres de tampon chaud 1x TIRF, puis 50 microlitres de graines de microtubules stabilisées et biotinylées à 50 %, diluées dans 1x tampon TIRF.

Réglez la platine ou l’objectif chauffant pour maintenir une température de 35 à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, avant d’imager la première réaction biochimique. Ensuite, réglez l’intervalle d’acquisition sur toutes les cinq secondes, pendant 15 à 20 minutes. Ensuite, réglez les expositions laser 488 et 647 sur 50 à 100 millisecondes à une puissance de 5 % à 10 %, en ajustant d’abord la réaction de polymérisation pour initier l’assemblage du filament d’actine.

Acquérez les images à 647 nanomètres et effectuez les ajustements appropriés. Ensuite, ajustez la réaction de polymérisation dans un deuxième puits de perfusion conditionné, pour initier l’assemblage des microtubules. Visualisez à 488 nanomètres, et faites les ajustements appropriés.

Combinez trois microlitres de tubuline 488 de 10 micromolaires avec l’aliquote de 7,2 microlitres de tubuline non marquée par fluorescence de 100 micromolaires, pas plus de 15 minutes avant l’utilisation. Ensuite, combinez trois microlitres d’actine biotinylée diluée dans des volumes appropriés d’actine non marquée et marquée par fluorescence, de sorte que le mélange final soit de 12,5 micromolaires d’actine totale, avec un marquage fluorescent de 10 % à 30 %.

Préparez le mélange de cytosquelette en combinant deux microlitres de mélange d’actine de 12,5 micromolaires avec le mélange de tubuline, au plus tard 15 minutes avant l’imagerie. Conserver sur de la glace jusqu’à utilisation.

Préparez le mélange de réaction protéique en combinant tous les autres composants expérimentaux et protéines, y compris le tampon 2x TIRF, l’anti-blanchiment, les nucléotides, les tampons et les protéines accessoires. Incuber le mélange de cytosquelette dans le mélange de réaction protéique séparément, à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 secondes.

Pour initier la réaction, ajoutez le contenu du mélange de réaction protéique au mélange de cytosquelette et mélangez-le. Versez 50 microlitres du mélange réactionnel contenant 1 tampon TIRF complété par 15 micromolaires de tubuline libre, un millimolaire de GTP, 0,5 micromolaire de monomères d’actine et des volumes appropriés de tampons de contrôle dans la chambre de perfusion.

Enregistrez une vidéo en accéléré à l’aide d’un logiciel de microscope, à acquérir toutes les cinq secondes, pendant 15 à 20 minutes. Conditionnez un nouveau puits de perfusion et remplacez le volume tampon par la protéine régulatrice d’intérêt et les contrôles tampons. Acquérir pour évaluer les protéines régulatrices des fonctions émergentes des microtubules d’actine.