Microscopie à fluorescence intravitale pour étudier la formation de thrombus microvasculaires

La microscopie à fluorescence intravitale est utile pour étudier l’induction phototoxique de la formation d’un thrombus – un caillot sanguin – au niveau d’un site de lésion microvasculaire.

Commencez par prendre une souris anesthésiée sans poils injectée d’un polysaccharide phototoxique marqué au fluorophore. Placez la souris en position couchée sur une plate-forme chauffante pour maintenir la température physiologique pour une bonne circulation sanguine.

Placez la partie apicale de l’oreille sous un microscope à fluorescence intravitale. Lors de l’excitation avec la lumière, le fluorophore émet une fluorescence, ce qui permet de surveiller le flux sanguin microvasculaire. Augmentez l’intensité lumineuse pour induire la formation de thrombus.

Le fluorophore absorbe la lumière de haute intensité et réagit avec l’oxygène moléculaire pour générer des espèces réactives de l’oxygène. Ces molécules provoquent un stress oxydatif dans les cellules endothéliales, entraînant ainsi des lésions cellulaires et l’exposition de la matrice sous-endothéliale.

Les cellules endommagées libèrent des médiateurs thrombotiques qui font le pont entre le collagène exposé dans la matrice sous-endothéliale et les plaquettes circulantes, qui se lient aux médiateurs via des récepteurs spécifiques.

La liaison active les plaquettes, provoquant la libération de molécules effectrices qui activent et recrutent d’autres plaquettes circulantes sur le site de la lésion. Les protéines de fibrinogène circulantes se lient aux récepteurs du fibrinogène sur les plaquettes activées, les liant pour former un bouchon plaquettaire.

Visualisez le flux sanguin restreint pour confirmer le bouchon plaquettaire - la première étape de la formation du thrombus.

Placez l’animal sur la plate-forme sous le stéréomicroscope. Utilisez un grossissement de 10X. Pour la microscopie de l’oreille droite, préparez la veine jugulaire gauche en créant d’abord une incision de 5 millimètres dans la peau du cou dans une direction cranio-caudale. Ensuite, utilisez des micro-pinces et des microciseaux pour disséquer le tissu sous-cutané. Ensuite, libérez la veine de ses adventices sans toucher le vaisseau.

Maintenant, utilisez la seringue à insuline préalablement préparée pour l’injection du colorant fluorescent. Saisissez délicatement la paroi du vaisseau avec la micro-pince sans perforer la veine. Pénétrez la paroi distendue du vaisseau avec l’aiguille de la seringue et injectez du FITC-dextran par voie intraveineuse. Retirez l’aiguille et arrêtez le saignement à l’aide de cotons-tiges. Évitez la contamination de l’oreille par le sang et les colorants.

Transférez l’animal sur la plaque chauffante dans une construction en verre acral avec une fente pour la plaque chauffante et un plan de 0,5 centimètre de haut pour positionner l’oreille. Fixez l’animal en position couchée sur la plaque chauffante à l’aide d’un bandage adhésif. Placez le cartilage convexe à la base de l’oreille à côté du plan de l’oreille afin que la partie apicale de l’oreille puisse être positionnée à plat sur le plan. Ajoutez une goutte d’aqua à température ambiante dans la plaque de verre acral. À l’aide de cotons-tiges, absorbez la goutte d’eau et laissez les forces capillaires fixer le plan de l’oreille au verre acral.

Le pavillon de l’oreille doit être positionné le plus à plat possible, même si le cartilage donne au pavillon une forme convexe. Ainsi, seule la partie distale la plus flexible du pavillon doit être positionnée sur la plaque de verre acral. Pour éviter d’endommager les tissus et d’extravaser le colorant gelé, touchez l’oreille le moins possible avec la pince.

Ensuite, ajoutez une goutte d’aqua sur la face dorsale convexe de l’oreille. Placez soigneusement une lamelle sur l’oreille sans comprimer les vaisseaux basaux entrant dans l’oreille. Utilisez des cotons-tiges pour enlever autant d’eau que possible sous la lamelle, afin de minimiser la distance entre la lamelle et les vaisseaux cibles de l’oreille.

Commencez par régler le microscope à fluorescence intravital pour la visualisation FITC-dextran. Transférez l’animal préparé sur le bureau du microscope à fluorescence intravital. À l’aide d’un grossissement de 5X, 10X et 20X et d’une intensité lumineuse de 20 %, recherchez un vaisseau veineux de 50 à 60 microns de diamètre et avec un flux sanguin antérograde.

Ajoutez une goutte d’eau à température ambiante dans la lamelle pour l’immersion dans l’eau de l’objectif de grossissement 63X. Immédiatement après l’application de la goutte d’eau, commencez à enregistrer le récipient pendant 20 secondes pour l’évaluation de base du diamètre et du débit sanguin. Commencer l’induction du thrombus 5 minutes après l’injection de FITC-dextran. Pour ce faire, augmentez l’intensité lumineuse à 100 %.

Lors de l’induction d’un thrombus phototoxique, fermez l’ouverture du microscope pendant 2 secondes sur une période de 30 secondes pour vérifier l’occlusion du flux sanguin. Si le flux sanguin persiste, ouvrez à nouveau l’ouverture. Le vaisseau est classé comme occlus si le flux reste immobile pendant 30 secondes ou plus, ou si le flux sanguin est rétrograde. Sélectionner et obstruer cinq vaisseaux par oreille dans une période de 1 heure après l’injection de FITC-dextran.