Optimisé basé sur la PCR Détection de Mycoplasma

L'objectif général de cette procédure est de démontrer visuellement les étapes permettant d'utiliser le kit de détection PCR Mycoplasma Lookout, optimisé pour détecter une contamination par des mycoplasmes. Cette détection est réalisée en chauffant d'abord les échantillons à 95 degrés Celsius afin d'inactiver toute molécule d'ADN pouvant rendre le modèle souhaité inadapté à la PCR. Ensuite, préparer les échantillons pour la PCR à l'aide des tubes fournis, préalablement chargés avec des nucléotides, des amorces et de l'ADN de contrôle interne.

La troisième étape de la procédure consiste en un cyclage thermique effectué dans des conditions soigneusement optimisées afin d'obtenir une sensibilité maximale et d'éliminer l'amplification non spécifique. En fin de compte, les résultats peuvent être obtenus pour déterminer si les échantillons en question sont contaminés par des mycoplasmes, grâce à une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que les réactifs sont préalablement aquatiques et que des tubes PCR de haute qualité sont utilisés.

Cela le rend plus pratique et efficace. Un autre avantage de ce kit est qu'il nécessite moins de deux génomes de mycoplasmes par microlitre d'échantillon pour détecter une contamination. Lors de la réalisation de la procédure de détection des mycoplasmes, il est important d'éviter toute contamination possible, en portant des équipements de protection individuelle appropriés afin de minimiser l'exposition de la peau, en s'assurant que tous les réactifs utilisés sont exempts de contamination et en respectant en permanence une technique aseptique adéquate.

La procédure peut être réalisée soit directement sur les surnageants de culture cellulaire, soit sur des échantillons préparés pour une utilisation ultérieure. Pour préparer les échantillons en vue d'une utilisation ultérieure, placer 100 microlitres de chaque surnageant dans un tube d'amplification stérile et incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l'incubation, les échantillons peuvent être conservés entre 2 et 8 degrés Celsius pendant une durée maximale d'une semaine.

Juste avant de tester les échantillons, effectuez une courte centrifugation afin de faire tomber tout débris cellulaire au fond du tube. Pour préparer les échantillons destinés à la PCR, déterminez d'abord le volume total de tampon de réhydratation de la polymérase ADN nécessaire aux réactions. Une unité de polymérase ADN par réaction doit être ajoutée au volume approprié de tampon de réhydratation, qui varie selon le TAC utilisé ; dans cette démonstration, le JumpStart TAC D 93 0 7 sera utilisé pour cinq réactions, soit trois échantillons plus un témoin positif et un témoin négatif.

Placer le volume calculé de polymérase ADN dans un tube de microcentrifugeuse propre, puis ajouter le volume calculé de tampon de réhydratation. Mélanger délicatement le tampon de réhydratation de la polymérase ADN en tapotant légèrement le tube. Ne pas vortexer ce mélange.

Utilisez les tubes à réaction transparents fournis dans le kit pour préparer le témoin négatif et les échantillons. Ces tubes à réaction contiennent déjà les nucléotides, les amorces et l'ADN du contrôle interne ; ajoutez 23 microlitres du tampon de réhydratation de l'ADN polymérase préparé précédemment. Mélangez dans chacun des tubes du témoin négatif et des échantillons.

Ensuite, ajoutez deux microlitres d'eau sans ADN au témoin négatif et deux microlitres de chaque échantillon dans les tubes respectifs. Mélangez le contenu en tapotant doucement les tubes. Le contenu ne doit pas être vortexé.

Pour préparer le témoin positif, utilisez les tubes à réaction roses fournis dans le kit. Ces tubes à réaction contiennent déjà les nucléotides, les amorces et l'ADN de contrôle interne ; ajoutez 25 microlitres de mélange tampon de réhydratation de la polymérase ADN au tube à réaction. Mélangez le contenu en tapotant doucement le tube ; ne pas vortexer les contenus.

Incubez ensuite les tubes de contrôle positif, de contrôle négatif et les tubes d'échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Après cinq minutes, transférez tous les tubes de réaction vers un thermocycleur. Pour la PCR, réglez les conditions suivantes pendant 40 cycles.

94 degrés Celsius pendant 30 secondes. 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant 40 secondes. Une étape d'activation n'est pas nécessaire lorsqu'on utilise Jumpstart tack.

Une fois les cycles de PCR terminés, retirez les échantillons du thermocycleur et placez-les sur de la glace pour les refroidir à une température comprise entre quatre et huit degrés Celsius. Les échantillons peuvent ensuite être chargés directement sur un gel d'agarose pour électrophorèse : chargez huit microlitres de chaque réaction de PCR dans une lame distincte. Aucun tampon ni colorant de chargement n'ont besoin d'être ajoutés avant le chargement des échantillons, car ils sont déjà inclus dans les tubes de réaction.

Arrêter l'électrophorèse une fois que le colorant témoin a migré de 2,5 à trois centimètres. Les résultats représentatifs de la détection des mycoplasmes par PCR sont illustrés sur cette image d'une plage de gel aros. La plage 2 correspond au témoin négatif, qui doit présenter une bande à environ 481 paires de bases.

L'absence de la bande du témoin négatif à 481 paires de bases est un bon indicateur que le TAC utilisé n'était pas suffisamment sensible. Les échantillons positifs pour les mycoplasmes présenteront des bandes comprises entre 270 ± 8 paires de bases, comme illustré dans les pistes trois à six. La bande sera intense pour les échantillons fortement contaminés et faible pour les échantillons faiblement contaminés.

Tous les échantillons contiennent un contrôle négatif interne afin de démontrer que la PCR s'est déroulée comme prévu. Il est normal de ne pas observer le contrôle interne dans les échantillons fortement contaminés. L'absence de bande à la fois dans la gamme positive et négative, comme indiqué dans la piste sept, est un bon indicateur d'une inhibition des échantillons.

Si l'échantillon est inhibé. Les inhibiteurs de PCR peuvent être éliminés en effectuant une extraction d'ADN. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser toutes les étapes nécessaires décrites dans la procédure du kit, ainsi que comment interpréter les résultats et résoudre les problèmes éventuels.