Name: Optimisé basé sur la PCR Détection de Mycoplasma (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Découvrez la détection optimisée des contaminations Mycoplasma par PCR dans les cultures cellulaires. Cette méthode utilise le kit LookOut avec préparation d'échantillons, amplification thermique et électrophorèse sur gel d'agarose pour des résultats fiables.

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Financé par Sigma-Aldrich

1. Détection de Mycoplasma <ol><li> Surnageants de culture cellulaire peuvent être testés directement ou de l'échantillon peut préparés pour être utilisés à une date ultérieure. Afin de préparer pour une utilisation ultérieure placer 100 pi de surnageant dans un tube d'amplification stérile et incuber à 95 ° C pendant 5 minutes. Une fois cette opération terminée, l'échantillon peut être conservé à 2-8 ° C pendant jusqu'à une semaine. Juste avant l'exécution de l'échantillon de centrifuger brièvement (5 secondes) pour culotter les débris cellulaires. </li><li> Pour préparer les échantillons pour la PCR, de déterminer le volume total de l'ADN polymérase Taq Jumpstart / réhydratation tampon nécessaire pour les réactions. Nous allons préparer 5 réactions total. Cinq réactions, il faudra 2.5μl de Taq et 114.5μl de tampon de réhydratation. Celui-ci contiendra un minimum d'une unité de Taq par réaction et 22.5μl de tampon de réhydratation par réaction de l'échantillon et de contrôle négatif, plus de tampon de réhydratation 24.5μl pour le contrôle positif. 1 unité de la polymérase ADN par réaction doit être ajouté au volume approprié de tampon de réhydratation. Cela varie avec la Taq utilisé. </li><li> Placez le volume calculé de Taq ADN polymérase dans un microtube propre et suivre avec le volume calculé de tampon de réhydratation. L'ADN polymérase / réhydratation tampon doit être mélangée doucement en tapotant le tube. Ce mélange ne doit pas être un vortex. </li><li> Pour préparer le contrôle négatif et l'utilisation des échantillons des tubes de réaction transparente fournie dans le kit. Les tubes de réaction fourni dans le kit contiennent déjà les nuclueotides, amorces et l'ADN de contrôle interne. 23 pl d'ADN Jumpstart tampon Taq polymérase mélanger / réhydratation, tel que préparé dans les étapes précédentes, doit être placé dans chacun des témoins négatifs et des tubes d'échantillons. Ajouter 2 ul d'ADN d'eau libre pour le contrôle négatif et ajouter 2 pl de l'échantillon de chacun des tubes d'échantillon et l'étiquette. Mélangez le contenu en feuilletant les tubes. Contenu ne doit pas être un vortex. </li><li> Pour préparer le contrôle positif utiliser les tubes de réaction roses fourni dans le kit. Les tubes de réaction fourni dans le kit contiennent déjà les nuclueotides, amorces et l'ADN de contrôle interne. Ajouter 25 ul d'ADN Jumpstart mélange de Taq polymérase tampon / réhydratation, tel que préparé dans les étapes précédentes, pour les tubes de réaction et l'étiquette. Mélangez le contenu en feuilletant les tubes. Contenu ne doit pas être un vortex. Incuber le contrôle négatif, contrôle positif et les tubes d'échantillon à température ambiante pendant 5 minutes. </li><li> Pour la PCR qui aura lieu les échantillons doivent être placés dans un thermocycleur. Lorsque vous utilisez JumpStart Taq une étape d'activation n'est pas nécessaire. Placer les tubes de réaction dans le thermocycleur. Les cycles doivent être définis comme suit: 94 ° C pendant 30 secondes, 55 ° C pendant 30 secondes et 72 ° C pendant 40 secondes. Ces cycles se dérouleront de 40 fois. </li><li> Une fois les cycles de PCR ont terminé les échantillons doivent être refroidis à 4-8 ° C en les retirant du cycleur thermique et de les placer dans la glace. Lorsque les échantillons sont refroidis, ils doivent être chargés sur le gel d'agarose pour électrophorèse. Gel de chargement et de colorants ne sont pas nécessaires car ils sont déjà présents dans les tubes de réaction. Directement charge de 8 ul pour chaque PCR dans un couloir distinct. Arrêtez l'électrophorèse après la migration de 2,5 - 3,0 cm. </li></ol> 2. Les résultats représentatifs Le contrôle négatif doit montrer une bande à environ 481 pb. Ceci peut être vu dans la colonne de contrôle négatif sur le gel d'électrophorèse qui est montré au début de la vidéo. L'absence de la bande de contrôle négatif à 481 pb est un bon indicateur que l'activité de la polymérase n'a pas été utilisé sufficienttaq n'était pas assez sensible. Mycoplasma échantillons positifs indique les bandes dans la gamme de 270 ± 8 pb. Le groupe sera lourde pour les échantillons fortement contaminés et faible pour les échantillons légèrement contaminé. Les variations de l'intensité peut être vu dans les colonnes de l'échantillon positif sur le gel d'électrophorèse qui est montré au début de la vidéo. Tous les échantillons contiennent un contrôle interne négative de démontrer que le PCR s'est produite comme prévu. Il est normal de voir l'absence de contrôle interne sur des échantillons hautement contaminés. S'il n'ya pas une bande dans la gamme positive ou une bande dans la gamme négatif sur votre échantillon ceci est un bon indicateur que vos échantillons sont inhibés. Si l'échantillon est inhibé les inhibiteurs de la PCR peut être enlevée en effectuant une extraction d'ADN. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3057/3057fig1.jpg"> Bandes de la figure 1 Amplicon pertinents:. Résultats de la détection des mycoplasmes par PCR sont représentées. Voie 2 est le contrôle négatif, qui devrait montrer une bande à environ 481 pb. L'absence de la bande de contrôle négatif à 481 pb est un bon indicateur que la Taq utilisé n'était pas assez sensible. Mycoplasma échantillons positifs indique les bandes dans la gamme de 270 + 8 pb, comme indiqué dans les couloirs 3 - 6. Le groupe sera HEAvy pour les échantillons fortement contaminés (piste 6) et faible pour les échantillons légèrement pollués (piste 4). Tous les échantillons contiennent un contrôle interne négative (481 pb) pour démontrer que le PCR s'est produite comme prévu. Il est normal de voir l'absence de contrôle interne sur des échantillons hautement contaminés.

<ol><li>Wirth, M., Hauser, H., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+Sensitivity+of+Polymerase+Chain+Reaction+%28PCR%29+in+Comparison+with+Other+Methods+for+the+Detection+of+Mycoplasma+Contamination+in+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Specificity and Sensitivity of Polymerase Chain Reaction (PCR) in Comparison with Other Methods for the Detection of Mycoplasma Contamination in Cell Lines.</a> Journal of Immunological Methods. 164, 91-100 (1993).</li>
<li>Kong, H., Volokhov, D. V., George, J., Ikonomi, P., Chandler, D., Anderson, C., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+Cell+Culture+Enrichment+for+Improving+the+Sensitivity+of+Mycoplasma+Detection+Methods+Based+on+Nucleic+Acid+Amplification+Technology+%28NAT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amplification of Cell Culture Enrichment for Improving the Sensitivity of Mycoplasma Detection Methods Based on Nucleic Acid Amplification Technology (NAT).</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 223-232 (2007).</li>
<li>Volokhov, D. V., Graham, L. J., Borson, K. A., Chizhikov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+Testing+of+Cell+Substrates+and+Biologics%3A+Review+of+Alternative+Non-Microbiological+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma Testing of Cell Substrates and Biologics: Review of Alternative Non-Microbiological Techniques.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2011).</li>
</ol>

Les auteurs sont des employés de Sigma-Aldrich qui a produit les réactifs et les outils utilisés dans cet article.

En raison de l&#39;extrême sensibilité de la trousse, lorsqu&#39;il est effectué correctement le kit devrait donner des résultats précis indiquant si oui ou non votre échantillon a contamination par des mycoplasmes. Le kit a été optimisé pour une utilisation avec la polymérase Taq ADN JumpStart. Taqs autres peuvent être utilisés lors de la préparation des échantillons, mais la bande de contrôle interne à 481 pb devrait être présent pour indiquer la sensibilité propre de l&#39;alternative Taq. Il est possible pour les bandes positives pour exposer différentes densités en fonction du niveau de contamination. Il est possible d&#39;observer l&#39;absence de la bande de contrôle interne sur des échantillons fortement contaminés. En utilisant la prudence et la bonne technique pour préparer les échantillons pour prévenir la contamination sont cruciales pour bon. de détection en utilisant le kit de détection de Mycoplasma LookOut PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> LookOut Mycoplasma kit de détection par PCR </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0035 </td><td> </td></tr><tr><td> Polymérase ADN Taq JumpStart </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307 </td><td> </td></tr><tr><td> GenElute kit ADN génomique de sang </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MP0030 </td><td> </td></tr><tr><td> Tubes d&#39;amplification Nunc </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0447 </td><td> </td></tr></tbody></table>

optimisé basé sur la pcr détection de mycoplasma

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

L&#39;entretien de lignées de cellules sans contamination est essentiel à la cellule de base de la recherche. Parmi les préoccupations les plus importantes de contaminants sont contamination par des mycoplasmes. Bien que les mycoplasmes ne sont généralement pas tuer les cellules contaminées, elles sont difficiles à détecter et peuvent causer une variété d&#39;effets sur les cellules cultivées, y compris le métabolisme modifié, a ralenti la prolifération et des aberrations chromosomiques. En bref, contamination par des mycoplasmes compromet la valeur de ces lignées cellulaires en fournissant des données précises pour la recherche en sciences de vie. Les sources de contamination par des mycoplasmes dans le laboratoire sont très difficiles à contrôler complètement. Comme certaines espèces de mycoplasmes sont trouvés sur la peau humaine, ils peuvent être introduits par une technique aseptique pauvres. En outre, ils peuvent provenir de compléments contaminés tels que le sérum de veau foetal, et surtout à partir d&#39;autres cultures de cellules contaminées. Une fois que les mycoplasmes contamine une culture, il peut se propager rapidement à contaminer d&#39;autres régions du laboratoire. Le strict respect bonnes pratiques de laboratoire telles que de bonnes techniques d&#39;asepsie sont la clé, et les tests de routine pour le mycoplasme est fortement recommandé pour le contrôle réussie de contamination par des mycoplasmes. Basées sur la PCR de détection des mycoplasmes est devenue une méthode très populaire pour l&#39;entretien de lignée cellulaire de routine. Méthodes de détection basées sur la PCR sont très sensibles et peuvent fournir des résultats rapides, ce qui permet aux chercheurs de répondre rapidement à isoler et à éliminer la contamination une fois qu&#39;il est détecté par rapport à la durée nécessaire en utilisant des techniques microbiologiques. Le kit de détection par PCR LookOut Mycoplasma est très sensible, avec une limite de détection de seulement 2 génomes par ul. Profitant de la polymérase très spécifiques JumpStart Taq ADN et une conception d&#39;amorce de propriété, les faux positifs sont considérablement réduits. La pratique de 8 tubes de format, des bandes pré-enduites de dNTP et amorces associé contribue à augmenter le débit pour répondre aux besoins des clients avec de plus grandes collections de lignées cellulaires. Compte tenu de l&#39;extrême sensibilité de la trousse, le plus grand soin doit être pris pour prévenir la contamination accidentelle des échantillons et des réactifs. Le protocole étape par étape, nous démontrons souligne les précautions et les pratiques nécessaires pour la détection de mycoplasmes fiable. Nous montrons aussi et discuter des résultats typiques et leur interprétation. Notre objectif est d&#39;assurer la réussite des chercheurs utilisant le kit de détection de Mycoplasma LookOut PCR.

Le kit de détection par PCR LookOut Mycoplasma utilise la réaction en chaîne polymérase (PCR), qui est établi que la méthode de choix pour plus de sensibilité dans la détection de la contamination par Mycoplasma, Acholeplasma et Ureaplasma dans des cultures cellulaires et de culture de cellules dérivées d&#39;autres produits biologiques.

Optimisé basé sur la PCR Détection de Mycoplasma

Le maintien de lignées cellulaires exemptes de contamination est essentiel à la recherche basée sur les cellules. Parmi les préoccupations majeures en matière de contaminants figure la contamination par les mycoplasmes. ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer visuellement les étapes permettant d'utiliser le kit de détection PCR Mycoplasma Lookout, optimisé pour détecter une contamination par des mycoplasmes. Cette détection est réalisée en chauffant d'abord les échantillons à 95 degrés Celsius afin d'inactiver toute molécule d'ADN pouvant rendre le modèle souhaité inadapté à la PCR. Ensuite, préparer les échantillons pour la PCR à l'aide des tubes fournis, préalablement chargés avec des nucléotides, des amorces et de l'ADN de contrôle interne.La troisième étape de la procédure consiste en un cyclage thermique effectué dans des conditions soigneusement optimisées afin d'obtenir une sensibilité maximale et d'éliminer l'amplification non spécifique. En fin de compte, les résultats peuvent être obtenus pour déterminer si les échantillons en question sont contaminés par des mycoplasmes, grâce à une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans le fait que les réactifs sont préalablement aquatiques et que des tubes PCR de haute qualité sont utilisés.Cela le rend plus pratique et efficace. Un autre avantage de ce kit est qu'il nécessite moins de deux génomes de mycoplasmes par microlitre d'échantillon pour détecter une contamination. Lors de la réalisation de la procédure de détection des mycoplasmes, il est important d'éviter toute contamination possible, en portant des équipements de protection individuelle appropriés afin de minimiser l'exposition de la peau, en s'assurant que tous les réactifs utilisés sont exempts de contamination et en respectant en permanence une technique aseptique adéquate.La procédure peut être réalisée soit directement sur les surnageants de culture cellulaire, soit sur des échantillons préparés pour une utilisation ultérieure. Pour préparer les échantillons en vue d'une utilisation ultérieure, placer 100 microlitres de chaque surnageant dans un tube d'amplification stérile et incuber à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l'incubation, les échantillons peuvent être conservés entre 2 et 8 degrés Celsius pendant une durée maximale d'une semaine.Juste avant de tester les échantillons, effectuez une courte centrifugation afin de faire tomber tout débris cellulaire au fond du tube. Pour préparer les échantillons destinés à la PCR, déterminez d'abord le volume total de tampon de réhydratation de la polymérase ADN nécessaire aux réactions. Une unité de polymérase ADN par réaction doit être ajoutée au volume approprié de tampon de réhydratation, qui varie selon le TAC utilisé ; dans cette démonstration, le JumpStart TAC D 93 0 7 sera utilisé pour cinq réactions, soit trois échantillons plus un témoin positif et un témoin négatif.Placer le volume calculé de polymérase ADN dans un tube de microcentrifugeuse propre, puis ajouter le volume calculé de tampon de réhydratation. Mélanger délicatement le tampon de réhydratation de la polymérase ADN en tapotant légèrement le tube. Ne pas vortexer ce mélange.Utilisez les tubes à réaction transparents fournis dans le kit pour préparer le témoin négatif et les échantillons. Ces tubes à réaction contiennent déjà les nucléotides, les amorces et l'ADN du contrôle interne ; ajoutez 23 microlitres du tampon de réhydratation de l'ADN polymérase préparé précédemment. Mélangez dans chacun des tubes du témoin négatif et des échantillons.Ensuite, ajoutez deux microlitres d'eau sans ADN au témoin négatif et deux microlitres de chaque échantillon dans les tubes respectifs. Mélangez le contenu en tapotant doucement les tubes. Le contenu ne doit pas être vortexé.Pour préparer le témoin positif, utilisez les tubes à réaction roses fournis dans le kit. Ces tubes à réaction contiennent déjà les nucléotides, les amorces et l'ADN de contrôle interne ; ajoutez 25 microlitres de mélange tampon de réhydratation de la polymérase ADN au tube à réaction. Mélangez le contenu en tapotant doucement le tube ; ne pas vortexer les contenus.Incubez ensuite les tubes de contrôle positif, de contrôle négatif et les tubes d'échantillon à température ambiante pendant cinq minutes. Après cinq minutes, transférez tous les tubes de réaction vers un thermocycleur. Pour la PCR, réglez les conditions suivantes pendant 40 cycles.94 degrés Celsius pendant 30 secondes. 55 degrés Celsius pendant 30 secondes et 72 degrés Celsius pendant 40 secondes. Une étape d'activation n'est pas nécessaire lorsqu'on utilise Jumpstart tack.Une fois les cycles de PCR terminés, retirez les échantillons du thermocycleur et placez-les sur de la glace pour les refroidir à une température comprise entre quatre et huit degrés Celsius. Les échantillons peuvent ensuite être chargés directement sur un gel d'agarose pour électrophorèse : chargez huit microlitres de chaque réaction de PCR dans une lame distincte. Aucun tampon ni colorant de chargement n'ont besoin d'être ajoutés avant le chargement des échantillons, car ils sont déjà inclus dans les tubes de réaction.Arrêter l'électrophorèse une fois que le colorant témoin a migré de 2,5 à trois centimètres. Les résultats représentatifs de la détection des mycoplasmes par PCR sont illustrés sur cette image d'une plage de gel aros. La plage 2 correspond au témoin négatif, qui doit présenter une bande à environ 481 paires de bases.L'absence de la bande du témoin négatif à 481 paires de bases est un bon indicateur que le TAC utilisé n'était pas suffisamment sensible. Les échantillons positifs pour les mycoplasmes présenteront des bandes comprises entre 270 ± 8 paires de bases, comme illustré dans les pistes trois à six. La bande sera intense pour les échantillons fortement contaminés et faible pour les échantillons faiblement contaminés.Tous les échantillons contiennent un contrôle négatif interne afin de démontrer que la PCR s'est déroulée comme prévu. Il est normal de ne pas observer le contrôle interne dans les échantillons fortement contaminés. L'absence de bande à la fois dans la gamme positive et négative, comme indiqué dans la piste sept, est un bon indicateur d'une inhibition des échantillons.Si l'échantillon est inhibé. Les inhibiteurs de PCR peuvent être éliminés en effectuant une extraction d'ADN. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser toutes les étapes nécessaires décrites dans la procédure du kit, ainsi que comment interpréter les résultats et résoudre les problèmes éventuels.

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