Isolement de lymphocytes à partir d'un patch de Peyer de souris

patchs de Peyer, PP, agrégats de tissus lymphoïdes organisés dans la paroi de l’intestin grêle, contiennent des cellules immunitaires, notamment des lymphocytes B, des lymphocytes T, des cellules dendritiques et des macrophages.

Pour isoler les lymphocytes des PP de souris, commencez par une souris euthanasiée. Inciser la paroi abdominale, exposant la cavité péritonéale. Localisez le cæcum. Disséquez la jonction iléo-caecélectrique pour séparer le caecum de l’intestin grêle.

Exciser le mésentère et inciser l’intestin grêle au niveau du duodénum pour retirer l’intestin grêle de la cavité péritonéale. Placez l’intestin grêle dans une plaque multipuits contenant du milieu réfrigéré et rincez pour enlever les débris.

Positionnez l’intestin grêle avec le côté mésentérique vers le bas et humidifiez avec du milieu pour maintenir l’hydratation des tissus. Identifiez les PP - des agrégats multi-lobulés blancs sur le côté anti-mésentérique de la paroi intestinale.

Excise soigneusement les PP, à l’exclusion des tissus intestinaux environnants. Transférer dans un tube contenant du fluide. Incuber sous agitation constante. Cette étape d’agitation détache le mucus, les débris cellulaires et toute matière fécale des PP, améliorant ainsi la récupération des lymphocytes PP.

Ensuite, transférez le tissu dans une passoire cellulaire avec une taille de maille appropriée. Perturbez doucement les PP et libérez les cellules. Rincer avec du milieu à travers la passoire pour obtenir une suspension de lymphocytes unicellulaires. Centrifuger la suspension à basse température pour maintenir la stabilité de la cellule.

Remettre les lymphocytes en suspension dans le milieu et utiliser pour une analyse plus approfondie.

Commencez par placer une souris en position couchée et stérilisez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Faites une incision abdominale médiane à travers la peau et le péritoine, du pubis à la cage thoracique, pour ouvrir la cavité péritonéale et localiser le caecum et la jonction iléo-calescale.

Faites une incision aussi distale que possible, à la jonction pour séparer l’intestin grêle du cæcum, et coupez le mésentère avec des ciseaux pour retirer soigneusement tout l’intestin grêle jusqu’au sphincter pylorique.

Coupez la jonction entre le pylore et le duodénum pour détacher complètement l’intestin grêle de la cavité abdominale, et placez l’intestin grêle isolé dans un puits d’une plaque à six puits contenant un milieu RPMI froid, complété par 10 % de sérum de veau fœtal ou FBS sur glace. Ensuite, agitez doucement les tissus manuellement jusqu’à ce que tous les segments soient immergés dans le milieu froid.

Lorsque tous les intestins ont été prélevés, utilisez une pince pour saisir la graisse mésentérique d’un bord de l’intestin et placez l’échantillon - côté mésentérique vers le bas - sur une serviette en papier. Humidifiez tout le segment intestinal avec du RPMI plus 10 % de FBS pour éviter la déshydratation et l’adhérence des tissus, et localisez les plaques de Peyer, qui apparaissent sous forme d’agrégats multilobés blancs en forme de chou-fleur sur le côté anti-mésentérique de la paroi intestinale.

Pour récolter les patchs de Peyer, utilisez des ciseaux chirurgicaux incurvés avec la courbe vers le haut pour exciser doucement chaque patch de ses bords distaux et proximaux, en prenant soin d’exclure le tissu intestinal environnant, et placez les patchs de Peyer dans des puits individuels d’une plaque de 12 puits contenant du RPMI glacé plus 10 % de FBS, sur de la glace, au fur et à mesure qu’ils sont collectés.

Lorsque tous les patchs ont été acquis, utilisez des ciseaux pour couper la pointe d’une pointe de micropipette de 1 millilitre afin que le diamètre soit suffisamment grand pour aspirer des patchs de Peyer individuels, et transférez les patchs de Peyer dans un tube conique de 150 millilitres par souris, contenant 25 millilitres de 37 degrés Celsius RPMI plus 10 % FBS.

Ensuite, placez les tubes dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius avec une agitation continue à 125 à 150 tr/min pendant 10 minutes. À la fin de l’agitation, transférez les patchs de Peyer sur une crépine de cellules de 140 micromètres par souris, et utilisez l’extrémité en caoutchouc du piston de seringue de 110 millilitres par animal pour perturber doucement les patchs de Peyer à travers le maillage en tubes coniques individuels de 50 millilitres.

Rincez les crépines avec 15 à 20 millilitres de RPMI froid plus 10 % FBS, et récupérez les cellules par centrifugation. Après avoir soigneusement jeté le surnageant, remettez les cellules en suspension à environ 1 x 10⁷ cellules par millilitre de RPMI plus une concentration de 10 % de FBS pour le comptage. Ensuite, transférez 2 à 2,5 x 10⁶ cellules par 200 microlitres de milieu, dans chaque puits d’une plaque inférieure ronde de 96 puits, et granulez les cellules par centrifugation.