Name: Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de lPlanaires Japonica Dugesia /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Découvrez les essais de régénération chez les planaires Dugesia japonica par manipulations pharmacologiques et génétiques. Ces méthodes permettent d'étudier la différenciation des cellules souches et la polarité régénérative in vivo.

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Le travail en laboratoire est soutenu par la NSF (MCB0919933) et le NIH (GM088790).

1. Dosage de la régénération Tronc fragment <ol><li> Arrêtez de nourrir une cohorte de vers au moins 5 jours avant le test de régénération pour assurer les animaux sont exempts de déchets et de la nourriture ingérée (~ 30 vers intacte, chaque ver ~ 8-10 mm de long après-faim). </li><li> Le jour du test, rincer un plat pré-gelé glace nivelé avec de l'eau et couvrir la surface plane glacé avec une pellicule de plastique. En utilisant des pinces, placer un papier filtre sur la pellicule de plastique. </li><li> Humidifier le papier filtre avec quelques gouttes d'eau de source. Transfert planaires sur le filtre (&lt;20 vers par filtre) à l'aide d'une pipette de transfert. Les vers peuvent être repositionnées sur le filtre, si nécessaire, par repipetting avec de l'eau plus de ressort. Retirer l'excès de liquide. </li><li> Avec un scalpel, amputer la tête par une seule coupe faite à mi-chemin entre le sommet antérieur de l'animal et l'extrémité antérieure du pharynx (figure 1A). </li><li> Avec un scalpel, amputer la région de la queue par une coupe simple fait environ mi-chemin entre la queue de l'animal et l'extrémité postérieure du pharynx (figure 1A). Retirer l'excès de mucus sur l'utilisation du scalpel une serviette en papier humidifié avec de l'éthanol à 70% après la coupe. Essuyez l'excès d'éthanol à partir de scalpel. </li><li> Transfert filtre via une pince dans une boîte de Pétri (100 mm x 25 mm de profondeur) contenant de l'eau au printemps. Attendre environ 3 minutes (pour fermeture de la plaie, observables par un pincement et assombrissement de la plaie). </li><li> Rincez les fragments du tronc du papier filtre dans une boîte de Pétri contenant du milieu désiré pour l'essai de régénération et de transfert d'incubateur thermostaté (24 ° C). </li><li> Score phénotype régénératrice après ~ 1 semaine, lorsque les structures sont identifiables régénéré (figure 1A). </li></ol> 2. La manipulation pharmacologique de la régénération: bipolarité induite par le praziquantel <ol><li> Préparer le praziquantel (PZQ) des stocks de médicaments par solubilisation dans le DMSO (62.4mg PZQ dans 1mL pour le stock 200mm). Utilisez le même jour. </li><li> Faire 50mL d'une solution contenant des médicaments (90 PZQ uM) en sels Montjuch tamponné. Vortex pour ~ 1 minute pour assurer une dispersion. </li><li> Effectuer test fragment de tronc de régénération tel que détaillé ci-dessus [le protocole n ° 1], exposant une cohorte de fragments de tronc pour PZQ à l'étape finale [1.7]. </li><li> Après 24-48 heures, l'échange PZQ milieux contenant de l'eau au printemps, laver plusieurs vers (&gt; 3) fois. </li><li> Retour vers l'incubateur. Score bipolarité (deux têtes, figure 1B) une semaine après la coupe. </li></ol> 3. La manipulation génétique de la régénération: dans le protocole in vivo d'alimentation ARNi <ol><li> Avant de dosage, de préparer un homogénat de foie de poulet. Jeter gras, jaune sections colorées à partir Foodstock, et le foie de purée restante. Filtre de purée travers un tamis et une suspension pour le stockage aliquote (1,5 ml tubes, -20 ° C). </li><li> Avant de dosage, de préparer bovins globules rouges (hématies) par aliquotage approvisionnement en échantillons de 1 ml, conservés à -20 ° C. </li><li> Sélectionner des vers pour l'ARNi. Trois cohortes sont utilisés: le gène d'intérêt, le contrôle positif (gène avec l'ARNi phénotype est connu; figure 1C, D &amp; E) de contrôle et de négatif (gène sans phénotype ARNi, également utile pour l'évaluation des niveaux de knockdown par rapport à la cohorte expérimentale). Pour chaque cohorte, l'utilisation des vers ~ 250 (~ 8-10 mm de long après avoir faim pendant au moins 5 jours). Conserver dans l'eau de source dans la baignoire en plastique. </li><li> Pour chaque action de cohorte ARNi dégel, de E. coli exprimant le gène d'intérêt ARNdb ciblant [8], avec un tube de l'homogénat de foie de volaille [3,1] et un tube de globules rouges [3,2]. </li><li> Pellet bactéries (13 000 g, 1 minute). Retirer le surnageant et remettre le culot dans 2xYT médias (~ 700μl). Recentrifuger, éliminer le surnageant place, granulés sur la glace. </li><li> Créer un grand alésage P200 pointe de la pipette en coupant l'extrémité de la pointe. Bien resuspendre le culot bactérien dans un mélange de foie de volaille homogénat (150 pi) et les globules rouges (50 pi) de créer des ARNi mélange d'alimentation. Retirer les bulles d'air par centrifugation. </li><li> Pour l'alimentation, retirer la majorité de l'eau de la baignoire en plastique contenant des vers (laisser la profondeur ~ 1 pouce). Swirl baignoire pour se concentrer vers le centre de ce récipient, mélanger la pipette d'alimentation ARNi dans un cercle parcage vers. Utiliser une pipette de transfert soigneusement coaxial évadés en arrière sur le mélange d'alimentation sans perturber l'ARNi autres convives! </li><li> Après l'alimentation (~ 1 heure), identifier les planaires qui ont nourri bien. Ces vers montrent une coloration rouge profond d'érythrocytes ingérés. Jeter les autres. </li><li> Replacez soigneusement l'alimentation solution avec de l'eau de source fraîche, minimisant les perturbations pour empêcher egestion de nourriture. Pour ce faire, doucement localiser les vers d'un côté du tube à l'aide d'une pipette de transfert, versez l'eau trouble, et remplacer l'eau fraîche tombait le mur opposé de la baignoire. Planaires Resubmerge rapidement que l'exposition prolongée à l'air entraîne également egestion alimentaire. </li><li> Librement soicouvercle du récipient et retourner à al incubateur (24 ° C) </li><li> Répétez protocole d'alimentation ARNi sur plusieurs cycles (~ 2-3 jours d'intervalle), entrecoupées de cycles de régénération [protocole n ° 1] à l'écran des phénotypes ARNi. Un protocole standard pour l'alimentation et la régénération efficace pour de nombreux gènes est montré dans la figure 2, ce qui prend environ 1 mois dans la durée totale. </li></ol> Modifier ce régime pour des gènes différents, comme le protocole optimal dépendra de facteurs tels que la stabilité des ARNm, localisation tissulaire, la perdurance de protéines, ou le développement d'un phénotype qui empêche les cycles d'alimentation multiple après régénération. Évaluer les niveaux knockdown simplement le dépistage de la pénétrance du phénotype (si apparente), ou par des approches qPCR pour comparer les niveaux d'ARNm ciblé avec la cohorte de contrôle négatif. 4. Les résultats représentatifs: Le dosage de la régénération du tronc fragment est robuste tel que tous les vers doivent régénérer avec la normale antéro-postérieure («tête à la queue») de polarité. Ceci peut être obtenu dès que cinq jours après la coupe, facilitée par l'émergence de la ocelles antérieure (asterixed, figure 1A). Toutefois, la restauration complète des structures morphologiques perdus survient après une semaine. La manipulation pharmacologique de la régénération fragment de tronc par PZQ pour donner deux vers à tête (figure 1B) est aussi robuste (CE 50 = 87 (+ -) fragments bipolaires 11%, 70μM PZQ pour 48 heures 20). La bipolarité se produit sur un seul cycle de régénération. Moindre efficacité dans ces essais concerne vraisemblablement des problèmes avec la solubilité des médicaments et / ou le stockage ou l'utilisation d'une espèce différente, où plathelminthes PZQ est inefficace. Pour les médicaments à faible pénétrance, un indice anteriorization est souvent utilisé pour marquer phénotypes intermédiaires côté de 22 bipolarité complète. Phénotypes résultant de l'ARNi des constructions de contrôle positifs sont présentés dans la figure 1: l'ARNi des Dugesia japonica six 1 (D j-six-1) se traduit par un phénotype eyeless 23 (figure 1C), d'ARNi Dugesia japonica PC2 (Dj-PC2) en résulte une perte de la réponse aversion pour la lumière 24 (figure 1D) et des ARNi Dugesia japonica βcatenin-1 (Dj-βcatenin-1) se traduit par un phénotype bicéphale 16-19, 21 à partir de fragments du tronc (figure 1E). Ces phénotypes peuvent être obtenus en utilisant les protocoles simples suivantes ARNi: Dj-six-1 (FFxFx), Dj-PC2 (FFFx), Dj-βcatenin-1 (FFxFx), où F = cycle d'alimentation et x = cycle de régénération, respectivement. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig1.jpg" alt="Figure 1"> Figure 1:... Test de régénération Tronc fragment A gauche, image de la planaire (en haut) et le schéma (au milieu) pour indiquer l'emplacement du fragment du tronc excisée Droite, timecourse de régénération fragment de tronc montrant l'aspect du fragment régénérant aux temps indiqués (jours) B Image de deux têtes planaire produite par l'exposition PZQ. C 'Eyeless «ver produite par Dj-six-1 ARNi. Perte de la réponse de l'aversion D de lumière dans les vers immobiles Dj-PC2 ARNi (coloré en rouge), comparé à un ver de contrôle mobile (tachés vert). E bipolaire planaire produit par Dj-βcatenin-1 ARNi. En BE, la fin originale antérieure du ver ARNi est orientée vers la gauche. <img src="/files/ftp_upload/3058/3058fig2.jpg" alt="Figure 2"> Figure 2: Séquence d'alimentation et de coupe pour les cycles de RNAi protocole typique comprenant plusieurs tétées (F), et les cycles de régénération (x) qui est efficace pour abattre de nombreux gènes dans D. japonica. La modification de ce protocole pour les gènes individuels peuvent être nécessaires pour obtenir des résultats optimaux, par exemple en utilisant un. Moindre (entre parenthèses) ou un plus grand nombre de cycles d'alimentation et de régénération

<ol><li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+the+regeneration+of+Planaria+maculata%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Entwm+Org%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of the regeneration of Planaria maculata.</a> Arch Entwm Org. 7, 364-397 Forthcoming.</li>
<li>Robb, S. M., Ross, E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SmedGD%3A+the+Schmidtea+mediterranea+genome+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">SmedGD: the Schmidtea mediterranea genome database.</a> Nucleic Acids Res. 36, 599-606 (2008).</li>
<li>Forsthoefel, D. J., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+patterns+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Emerging patterns in planarian regeneration.</a> Curr Opin Genet Dev. 19, 412-4120 (2009).</li>
<li>Adell, T., Cebrià, F., Saló, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+in+Planarian+Regeneration+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Gradients in Planarian Regeneration and Homeostasis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, (2010).</li>
<li>Agata, K., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+aspects+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular aspects of planarian regeneration.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 377-383 (1999).</li>
<li>Newmark, P. A. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat Rev Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Ann Rev Cell Dev Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Reddien, P. W., Bermange, A. L., Murfitt, K. J., Jennings, J. R., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+needed+for+regeneration%2C+stem+cell+function%2C+and+tissue+homeostasis+by+systematic+gene+perturbation+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes needed for regeneration, stem cell function, and tissue homeostasis by systematic gene perturbation in planaria.</a> Dev Cell. 8, 635-649 (2005).</li>
<li>Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F. &amp, Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+double-stranded+RNA+inhibits+gene+expression+in+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 11861-11865 (2003).</li>
<li>Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Analyses+Reveal+a+Role+for+Peptide+Hormones+in+Planarian+Germline+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Analyses Reveal a Role for Peptide Hormones in Planarian Germline Development.</a> PLoS Biology. 8, e10000509-e10000509 (2010).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+the+central+nervous+system%3A+how+easy+for+planarians%21%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Regenerating the central nervous system: how easy for planarians!</a> Dev Genes Evol. , 733-748 (2007).</li>
<li>Mineta, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+evolutionary+process+of+the+CNS+elucidated+by+comparative+genomics+analysis+of+planarian+ESTs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7666-7671 (2003).</li>
<li>Oviedo, N. J., Nicolas, C. L., Adams, D. S., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Model+Organisms%5BTitle%5D)+AND+%22A+Laboratory+Manual+Chapter%22%5BJournal%5D)">Emerging Model Organisms.</a> A Laboratory Manual Chapter. 8, (2009).</li>
<li>Buttarelli, F. R., Pellicano, C., Pontieri, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropharmacology+and+behavior+in+planarians%3A+translations+to+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuropharmacology and behavior in planarians: translations to mammals.</a> Comp Biochem Physiol. 147, 399-408 (2008).</li>
<li>Sánchez-Alvarado, A., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA+specifically+disrupts+gene+expression+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA specifically disrupts gene expression during planarian regeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 5049-5054 (1999).</li>
<li>Gurley, K. A., Rink, J. C., Sánchez-Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-catenin+defines+head+versus+tail+identity+during+planarian+regeneration+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Beta-catenin defines head versus tail identity during planarian regeneration and homeostasis.</a> Science. 319, 323-327 (2008).</li>
<li>Yazawa, S., Umesono, Y., Hayashi, T., Tarui, H., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+Hedgehog%2FPatched+establishes+anterior-posterior+polarity+by+regulating+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Planarian Hedgehog/Patched establishes anterior-posterior polarity by regulating Wnt signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 22329-22334 (2009).</li>
<li>Petersen, C. P., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smed-betacatenin-1+is+required+for+anteroposterior+blastema+polarity+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Smed-betacatenin-1 is required for anteroposterior blastema polarity in planarian regeneration.</a> Science. 319, 327-330 (2008).</li>
<li>Iglesias, M., Gomez-Skarmeta, J. L., Saló, E., Adell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Smed-betacatenin1+generates+radial-like+hypercephalized+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Silencing of Smed-betacatenin1 generates radial-like hypercephalized planarians.</a> Development. 135, 1215-1221 (2008).</li>
<li>Nogi, T., Zhang, D., Chan, J. D., Marchant, J. S., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+biological+activity+of+praziquantel+requiring+voltage-operated+Ca2%2B+channel+beta+subunits%3A+subversion+of+flatworm+regenerative+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A novel biological activity of praziquantel requiring voltage-operated Ca2+ channel beta subunits: subversion of flatworm regenerative polarity.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e464-e464 (2009).</li>
<li>Oviedo, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+neural+and+gap+junction+protein-mediated+cues+control+polarity+during+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-range neural and gap junction protein-mediated cues control polarity during planarian regeneration.</a> Dev Biol. 339, 188-199 (2010).</li>
<li>Nogi, T., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+innexin+gene+expression+and+functional+roles+of+gap-junctional+communication+in+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of innexin gene expression and functional roles of gap-junctional communication in planarian regeneration.</a> Dev Biol. 287, 314-335 (2005).</li>
<li>Mannini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Djeyes+absent+%28Djeya%29+controls+prototypic+planarian+eye+regeneration+by+cooperating+with+the+transcription+factor+Djsix-1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Djeyes absent (Djeya) controls prototypic planarian eye regeneration by cooperating with the transcription factor Djsix-1.</a> Dev Biol. 269, 346-359 (2004).</li>
<li>Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+planarian+central+nervous+system+%28CNS%29+revealed+by+neuronal+cell+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Structure of the planarian central nervous system (CNS) revealed by neuronal cell markers.</a> Zoolog Sci. 15, 433-440 (1998).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les protocoles décrits ici en détail des essais pour étudier et manipuler la régénération de la planaire Dugesia japonica. Elles sont simples et ne nécessitent pas de matériel spécialisé tel qu&#39;ils peuvent être facilement réalisées en laboratoire ou en classe. Les dosages peuvent être effectués individuellement ou combinés (pour le dépistage génétique des produits chimiques des efficacités médicament in vivo) et peut être effectuée au niveau du gène candidat, ou sont adaptables à impartiales, dépistage du débit plus élevé 8. Que ce soit pour étudier la biologie fascinante des Planaires dans leur propre droit, ou pour évaluer la fonction in vivo des homologues de mammifères dans un modèle alternatif pour l&#39;étude de la régénération des tissus, ces approches devraient catalyser l&#39;intérêt d&#39;un large éventail de chercheurs.

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactifs </th><th> Vendeur </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> L&#39;eau de source </td><td> Kandiyohi. Prime Waters Inc Minneapolis, MN </td><td> n / a </td><td> D&#39;autres formes d&#39;eau de source bien travailler aussi. Premier essai dans des essais de viabilité. </td></tr><tr><td> 1 x tampon sels Montjuïch: NaCl (1.6mm), CaCl2 (1mm), MgSO4 (1mm), MgCl2 (0,1 mm), KCl (0,1 mm), NaHCO3 (1.2mm), HEPES (1,5 mm). pH 7,4 à 24 ° C. </td><td> Plusieurs fournisseurs </td><td> n / a </td><td> D&#39;eau artificielle pour les traitements médicamenteux au cours des essais de régénération pour assurer tamponnage du pH. Solution de 5 / 8 Holtfreter est une alternative. </td></tr><tr><td> 2xYT Bouillon </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2467-500 </td><td> Médias = 31 g / L. Autoclavés. </td></tr><tr><td> Boîte de Pétri (100x25mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-11 </td><td> Vers le logement pendant les cycles de régénération </td></tr><tr><td> Plat carré (100x100x15mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08 à 757-11A </td><td> Remplissez avec de l&#39;eau, du gel pour le bac de glace utilisée comme surface de coupe ver </td></tr><tr><td> Baignoire en plastique: n Twist Ziploc »Loc (16 oz). </td><td> Divers détaillants </td><td> n / a </td><td> Récipients d&#39;eau pour les cohortes serrées Pratique ARNi </td></tr><tr><td> Foie de poulet </td><td> Épiceries commerciaux </td><td> n / a </td><td> Biais vers des approvisionnements organiques, en raison de l&#39;évitement d&#39;antibiotiques. </td></tr><tr><td> Mélangeur à main </td><td> Tout fournisseur de cuisine </td><td> n / a </td><td> Utilisez pour faire la purée de foie de volaille </td></tr><tr><td> Fil 1mm mailles </td><td> Tout fournisseur de cuisine </td><td> n / a </td><td> Utilisez pour tamiser la purée de foie de volaille </td></tr><tr><td> Bovine globules rouges </td><td> Lampire laboratoires biologiques </td><td> 7240807 </td><td> 100% lavé et mis en commun la suspension de RBC </td></tr><tr><td> Circulaire papiers filtres </td><td> Whatman n ° 3 </td><td> 1003 055 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette de transfert </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-711-41 </td><td></td></tr><tr><td> Stériles, les lames chirurgicales </td><td> Plusieurs fournisseurs </td><td> n / a </td><td></td></tr><tr><td> ± Praziquantel </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4668 </td><td> Aliquotes Conserver la poudre dans l&#39;obscurité à 4 ° C. Dessécher. </td></tr><tr><td> Dj-six-1 </td><td></td><td> GenBank AJ557022.1 </td><td> ARNi contrôle positif de &quot;eye-moins&quot; 23 phénotype </td></tr><tr><td> Dj-βcatenin-1 </td><td></td><td> GenBank AB181913.1 </td><td> ARNi contrôle positif de deux têtes phénotype 17 </td></tr><tr><td> Dj-PC2 </td><td></td><td></td><td> ARNi contrôle positif pour la perte de l&#39;aversion au phénotype lumière 24 </td></tr></tbody></table>

pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;planaires japonica dugesia</em

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Plathelminthes planaire libre-vivants ont une longue histoire d&#39;utilisation en raison de leurs remarquables expérimentale capacités régénératrices 1. De petits fragments excisés de ces animaux de réforme au plan du corps d&#39;origine après la régénération des structures du corps manquant. Par exemple, si un fragment «tronc» est coupé à partir d&#39;un ver intacts, «tête» d&#39;une nouvelle va régénérer en avant et une «queue» se régénère arrière restaurer l&#39;original de polarité «tête-à-queue» des structures du corps avant l&#39;amputation (figure 1A). La régénération est tirée par les cellules souches planaire, connu comme &#39;néoblastes »qui se différencient en ~ 30 différents types de cellules lors de l&#39;homéostasie normale du corps et la régénération tissulaire appliquée. Ce processus de régénération est robuste et facile à démontrer. Grâce au dévouement de plusieurs laboratoires de pionnier, de nombreux outils et méthodes de génétique fonctionnelle ont été optimisés pour ce système modèle. Par conséquent, des progrès considérables ces dernières ont été réalisés dans la compréhension et la manipulation des événements moléculaires qui sous-tend planaire plasticité développementale 2-9. Le système modèle planaire sera d&#39;intérêt pour un large éventail de scientifiques. Pour les neuroscientifiques, le modèle offre la possibilité d&#39;étudier la régénération d&#39;un système nerveux entier, plutôt que de simplement la repousse / réparation des cellules nerveuses du processus unique qui sont généralement l&#39;objet d&#39;études dans de nombreux modèles établis. Planaires exprimer une multitude de neurotransmetteurs 10, représentent un système important pour étudier l&#39;évolution du système nerveux central 11, 12 et ont un potentiel de dépistage comportementale 13, 14. Régénérative résultats se prêtent à la manipulation par apparoaches pharmacologiques et génétiques. Par exemple, les médicaments peuvent être criblés pour les effets sur la régénération, simplement en plaçant des fragments de corps à la drogue contenant des solutions à différents moments après l&#39;amputation. Le rôle des gènes individuels peuvent être étudiés en utilisant des méthodes knockdown (ARNi in vivo), qui peut être atteint soit par des cycles de micro-injection ou par l&#39;alimentation des bactéries-exprimé construit ARNdb 8, 9, 15. Les deux approches peuvent produire des phénotypes visuellement frappant au-pénétrance de haute, par exemple, la régénération des animaux bipolaires 16-21. Afin de faciliter l&#39;adoption de ce modèle et l&#39;application de telles méthodes, nous présentons dans cet article la vidéo protocoles pour les essais pharmacologiques et génétiques (ARNi in vivo par l&#39;alimentation) en utilisant le Dugesia planaire japonica.

Un modèle intéressant pour étudier différenciation des cellules souches au sein d&#39;un animal vivant est le ver plat planaire. La régénération est étudiée par des expériences simples amputations qui sont facilement réalisées dans un laboratoire de base et sont susceptibles d&#39;être (pharmacologiques et génétiques<em&gt; In vivo</em&gt; ARNi) de manipulation tel que détaillé par des protocoles dans cet article.

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l&#39;Planaires Japonica Dugesia</em

Les plathelminthes planaires libres ont une longue histoire d'utilisation expérimentale en raison de leurs remarquables capacités de régénération1. De petits fragments excisés de...

L'objectif général des expériences suivantes est de réaliser et de manipuler des tests de régénération chez les vers plats de type Parian en utilisant des méthodes pharmacologiques ou des inhibitions génétiques. La première étape consiste à maîtriser le test de base d'amputation et de régénération. Ensuite, on montre comment des médicaments peuvent être utilisés pour modifier la polarité régénérative, par exemple afin d'obtenir des animaux à deux têtes.Enfin, une description est donnée de la manière d'effectuer un ARNi in vivo par alimentation, afin d'examiner les effets de la perte de fonction de gènes spécifiques. Les résultats montrent que le traitement avec le médicament quintal perturbe la régénération, produisant des vers à deux têtes, et que la diminution génétique d'une bétaine et d'une isoforme produit un phénotype grossièrement similaire.Bonjour, je m'appelle John Chan, étudiant diplômé au laboratoire Marching, et je vais vous montrer ces procédures. La démonstration visuelle de ces méthodes est importante, car bien qu'aucune étape individuelle ne soit difficile en soi, la présentation globale de ces techniques aidera les chercheurs qui débutent avec ce système modèle.En prévision du test, cesser de nourrir un groupe d'environ 30 parians pendant au moins cinq jours après la privation de nourriture. Le ver doit mesurer entre huit et dix millimètres de long le jour du test. Rincer un plat à glace préalablement nivelé avec de l'eau et recouvrir la surface plane glacée de film plastique à l'aide de pinces.Placer une feuille de papier filtre sur l'emballage en plastique. Humidifier le papier filtre avec quelques gouttes d'eau de source à l'aide d'une pipette de transfert, puis déposer au maximum 20 plin sur le filtre. Si nécessaire, les vers peuvent être repositionnés sur le filtre en effectuant une nouvelle pipette avec davantage d'eau de source.Une fois les vers en position, retirez tout liquide excédentaire à l’aide d’un scalpel, puis amputez la tête en effectuant une incision unique à environ mi-chemin entre l’extrémité antérieure de l’animal et l’extrémité antérieure du pharynx. Ensuite, amputez la région de la queue en effectuant une incision unique à environ mi-chemin entre l’extrémité postérieure de l’animal et l’extrémité postérieure du pharynx. Retirez le mucus excédentaire sur le scalpel à l’aide d’un papier essuie-tout humidifié avec de l’éthanol à 70 % après chaque incision, puis essuyez l’excès d’éthanol sur le scalpel avant de procéder à une nouvelle incision.Prendre le filtre avec des pinces et le transférer dans une boîte de Pétri contenant de l'eau de source. Attendre environ trois minutes pour la fermeture de la blessure, observable par un pincement et un assombrissement de la plaie. Rincer les fragments de tronc du papier filtre dans une boîte de Pétri contenant le milieu souhaité pour le test de régénération, puis transférer à un incubateur thermostaté réglé à 24 degrés Celsius.Évaluer le phénotype régénératif après environ une semaine. Lorsque les structures régénérées sont identifiables, préparer un stock de quintal ou de PZ Q à 200 millimolaire en solubilisant le médicament dans du DMSO, à utiliser frais le jour même. Ensuite, préparer 50 millilitres de solution contenant le médicament en ajoutant 22,5 microlitres du stock de PZ Q aux sels tamponnés majic, puis vortexer pendant environ une minute.Pour assurer une dispersion adéquate, placer les vers sur du papier filtre humidifié avec de l'eau de source et amputer les régions de la tête et de la queue comme décrit dans le test de régénération par fragmentation du tronc. Après l'amputation et la fermeture de la plaie, transférer les fragments tronculaires dans une boîte de Pétri contenant de l'eau de source. Changer le milieu pour une solution de PZ Q à 90 micromolaire et placer la boîte de Pétri dans l'incubateur à 24 degrés Celsius. Après 24 à 48 heures, remplacer le milieu contenant le PZ Q par de l'eau de source, rincer plusieurs fois le ver, replacer les vers dans l'incubateur, puis après une semaine, évaluer le phénotype de bipolarité ou de tête double des vers avant le test.Préparez un homogénéat de foie de poulet, éliminez les parties grasses de couleur jaune du stock alimentaire, puis mixez le foie restant. Filtrez le purée obtenu à l'aide d'une passoire à mailles fines et conservez la suspension aqueuse. Ensuite, préparez des érythrocytes de bovin ou GR par aliquotage de l'approvisionnement en échantillons d'un millilitre stockés à moins vingt degrés Celsius.Utilisez des vers ayant été privés de nourriture pendant cinq jours et répartissez-les en trois cohortes. Le gène d'intérêt, un contrôle positif correspondant à un gène dont le phénotype d'ARNi est connu, et un contrôle négatif, soit un gène ne présentant aucun phénotype d'ARNi.Pour chaque cohorte, utilisez environ 250 vers mesurant entre huit et dix millimètres de long. Décongelez un stock d’e coli pour chaque cohorte exprimant un ARN double brin ciblant les gènes d’intérêt, ainsi qu’un tube de foie de poulet homogénéisé et un tube de globules rouges. Récupérez les bactéries par centrifugation à 13 000 ×g pendant une minute, éliminez le surnageant et remettez en suspension le culot dans 700 microlitres de milieu 2XYT.Recentrifuger, éliminer le surnageant, puis placer le culot sur de la glace. Créer une pipette à embout large P200 en coupant soigneusement l'extrémité, puis resuspendre complètement le culot bactérien dans 150 microlitres d'homogénat de foie de poulet additionnés de 50 microlitres de globules rouges afin de préparer un mélange d'alimentation pour ARNi. Éliminer les bulles d'air par une courte centrifugation par impulsions avant l'alimentation.Retirez la majeure partie de l'eau du récipient en plastique contenant les vers, en laissant une profondeur d'environ un pouce. Faites tourbillonner le récipient pour concentrer les vers au centre de celui-ci. Ensuite, pipetez le mélange d'alimentation ARNi en cercle, encerclant les vers.Utilisez une pipette de transfert pour ramener délicatement les individus échappés sur le mélange d'alimentation en ARNi sans perturber les autres vers après une alimentation d'environ une heure, identifiez les parians bien nourris et retirez les vers qui ne semblent pas suffisamment alimentés. Les vers bien nourris présentent une coloration rouge foncé due aux globules rouges ingérés.Remplacez soigneusement la solution nutritive par de l'eau de source fraîche, en prenant soin de minimiser les perturbations afin d'éviter l'ingestion de nourriture. Pour ce faire, localisez délicatement les vers sur un côté du récipient à l'aide d'une pipette de transfert. Versez l'eau usée et remplacez-la soigneusement par de l'eau fraîche versée le long de la paroi opposée du récipient, en veillant à ce que les vers soient rapidement réimmergés, car une exposition prolongée à l'air peut être préjudiciable.Donne également des résultats peu précis concernant l'ingestion alimentaire. Fermer hermétiquement le couvercle du récipient et remettre les vers dans l'incubateur à 24 degrés Celsius. Répéter ce protocole d'alimentation par ARNi sur plusieurs cycles, alternés avec des cycles de régénération, afin de cribler finalement les phénotypes induits par l'ARNi.Un calendrier standard d'alimentation et de régénération, efficace pour de nombreux gènes, est indiqué ici. F représente le protocole d'alimentation et X représente le test de régénération. Au total, le protocole dure environ un mois et peut être modifié pour différents gènes en incluant moins d'alimentations, représentées par des parenthèses F, ou davantage d'alimentations, car le protocole optimal dépendra de facteurs tels que la stabilité de l'ARNm, la localisation tissulaire, la protéine, P dur, ou le développement d'un phénotype empêchant plusieurs cycles d'alimentation après la régénération.Voici des résultats typiques du test de régénération du tronc. À gauche, un parian est représenté au-dessus d'un schéma indiquant les coupes d'amputation. À droite, un suivi temporel de la régénération d'un fragment de tronc s'étalant sur sept jours, avec l'apparition de taches oculaires dès le troisième jour.Ici, la subversion pharmacologique de la régénération des fragments tronculaires par le traitement au PZ Q. a produit des vers à deux têtes en utilisant une ARNi ciblant le gène DJ 61. Dans un protocole d'alimentation FX FX, on observe un phénotype ilis ; la perte d'une réponse d'avoidance à la lumière, observée après un protocole d'alimentation FFFX, conduit à des vers immobiles DJ PC soumis à une ARNi, colorés en rouge par rapport au témoin mobile. Le ver coloré en vert correspond à une inhibition par ARNi de DJ bêta-caténine dans un individu.L'utilisation d'un protocole d'alimentation FXFX entraîne la régénération d'une tête à partir de la plaie postérieure. Après avoir suivi ces procédures, les chercheurs pourront cibler les gènes d'intérêt pour leurs recherches à l'aide de méthodes d'extinction ou d'agents pharmacologiques sélectifs afin d'explorer leur rôle dans la biologie pariétale et la régénération tissulaire.

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JoVE Journal

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Cette vidéo montre comment utiliser C. elegans afin d'évaluer la neurodégénérescence neurone dopaminergique comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Par ailleurs, cribles génétiques sont utilisés pour identifier les facteurs qui accentuent la dégénérescence ou sont neuroprotecteurs.

Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.

Immobilisation planaire, l&#39;irradiation partielle, et la transplantation de tissus

Étude génétique de la régénération des axones avec cultivées adultes dorsaux neurones ganglion de la racine

Approches pour tester les effets des médicaments antipsychotiques (APDS) dans Caenorhabditis elegans sont démontrés. Les dosages sont décrits pour tester les effets des médicaments sur le développement et sur la viabilité et le taux de pompage du pharynx. Ces méthodes sont également applicables pour les expériences pharmacogénétiques avec d'autres classes de médicaments que les PDA.

Méthodes pour étudier les mécanismes d&#39;action des antipsychotiques dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l'homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène.

Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve

Ce protocole montre comment exciser constamment les yeux planaires (tasses optiques) sans déranger les tissus environnants. En utilisant une aiguille d'insuline et d'une seringue, un ou les deux yeux peuvent être ablatée pour faciliter les enquêtes sur les mécanismes de régulation de la régénération des yeux, l'évolution de la régénération visuelle, et les bases neurales du comportement induite par la lumière.

Chirurgical Ablation Essai pour étude de la régénération des yeux dans planaires

La planaire Schmidtea mediterranea est un excellent modèle pour l’étude des cellules souches et la régénération des tissus. Cette publication décrit une méthode pour éliminer sélectivement un organe, le pharynx, en exposant les animaux à l’azoture de sodium chimique. Ce protocole décrit également les méthodes de suivi de la régénération du pharynx.

Amputation chimique et la régénération du Pharynx dans le planaire Schmidtea mediterranea

La motilité planaire est utilisée pour évaluer les propriétés stimulantes et de retrait des produits naturels par rapport au mouvement des animaux dans l’eau de source seulement.

Un test de motilité planaire pour évaluer les propriétés biomodulantes des produits naturels

Les planaires d’eau douce présentent trois démarches (glisse, péristalse et scrunching) qui se distinguent par l’analyse comportementale quantitative. Nous décrivons une méthode pour induire le scrunching utilisant divers stimuli nocifs, quantification de celui-ci, et la distinction du péristaltisme et de la glisse. En utilisant le knockdown de gène, nous démontrons la spécificité du scrunching comme lecture phénotypique quantitative.

Scrunching planaire comme une lecture comportementale quantitative pour la détection de stimuli nocifs

Ce protocole présente les étapes prises pour disséquer les ovaires chez les planaires d’eau douce, Schmidtea mediterranea. Les ovaires disséqués sont compatibles pour l’immunocoloration par anticorps et l’analyse ultrastructurale avec microscopie électronique à transmission pour étudier la biologie cellulaire des ovocytes et des cellules somatiques, offrant une profondeur et une qualité d’imagerie qui étaient auparavant inaccessibles.

Dissection planaire de l’ovaire pour l’analyse ultrastructurale et la coloration des anticorps

Ici, nous décrivons un protocole pour concevoir des cellules souches reprogrammées chimiquement afin d’obtenir une modulation neuronale précise en différenciant ces cellules en cellules précurseurs dopaminergiques, en les transplantant dans des modèles murins de la maladie de Parkinson et en évaluant les résultats comportementaux et électrophysiologiques pour confirmer l’intégration réussie et l’efficacité fonctionnelle des cellules transplantées.

Régulation chimiogénétique dans les cellules précurseurs dérivées de cellules souches reprogrammées dans le traitement des maladies neurodégénératives

Découvrez les essais de régénération chez les planaires Dugesia japonica par manipulations pharmacologiques et génétiques. Ces méthodes permettent d'étudier la différenciation des cellules souches et la polarité régénérative in vivo.

Pharmacologiques et des essais de génétique pour manipuler la régénération de l'Planaires Japonica Dugesia

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