Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand

L'objectif général de cette procédure est de reconstituer biochimiquement un complexe protéique du récepteur de stéroïdes avec la protéine HSB 90 et de réactiver l'activité de liaison du ligand au récepteur de stéroïdes, ce qui peut être utilisé pour tester les besoins en cofacteurs de la HSB 90 ainsi que les effets de l'ajout de composés exogènes au processus de reconstitution. Ceci est réalisé en préparant tout d'abord un cytosol cellulaire contenant des récepteurs glucocorticoïdes fonctionnels. Ensuite, le GR provenant du cytosol cellulaire est immunoadsorbé et endogène.

La protéine HSP 90 est dissociée. Ensuite, le complexe hétérodimère GR-HSP 90 est reconstitué à l'aide d'une source exogène d'HSP 90 ainsi que d'autres protéines chaperonnes et facteurs cofacteurs. Enfin, les complexes protéiques reconstitués et leur activité de liaison au ligand sont analysés spécifiquement par des méthodes telles que la migration sur gel SDS-PAGE, le transfert western et des tests de liaison à un ligand radioactif, utilisés pour démontrer la formation du complexe hétérodimère GR-HSP 90 et l'activité de liaison aux stéroïdes.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des chaperonnes moléculaires HSP 90, telles que quelles chaperonnes cofacteurs et quelles chaperonnes COS sont nécessaires pour faciliter l'activité fonctionnelle de l'HSP 90. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur le repliement des protéines, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme le développement de composés précurseurs dépendant de l'HSP 90 ou l'analyse des voies de signalisation intracellulaires nécessitant l'HSP 90. La procédure sera démontrée par Hannah Franklin et Nathan, deux étudiants récemment diplômés de mon laboratoire. Pour isoler un récepteur glucocorticoïde (GR) fonctionnel, cultiver des cellules de fibroblaste murin L 9 29 ou des cellules SF neuf, infectées par un virus recombinant GR bao, en phase de croissance exponentielle. Centrifuger la suspension cellulaire à 5 000 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Le culot obtenu doit avoir un volume d’environ un à cinq millilitres. Laver le culot cellulaire trois fois avec 15 millilitres de solution saline tamponnée au hank. Préparer un volume égal à 1,5 fois le volume initial de tampon d'homogénéisation contenant le tampon HEM, un millimolaire de fluorure de phényl méthylsulfonyle ou PMSF et trois comprimés complets mini d'inhibiteur de protéase broyés à l’aide de 50 allers-retours dans un mortier.

L'homogénéisateur a rompu les cellules ; effectuez cette étape sur de la glace pour prévenir la dégradation des protéines. Ultracentrifugez l'homogénat à 100 000 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Aliquoter le surnageant contenant le cytosol dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre, par 500 microlitres chacun, et stockez à moins 20 degrés Celsius.

Pour préparer un mélange contenant un anticorps monoclonal IgG dirigé contre le récepteur spécifique GR, combiner 100 microlitres de cytosol GR décongelé, 200 microlitres de tampon TEGM, 100 microlitres d'une suspension à 20 % de PAS ou d'aséroprotéine et cinq microgrammes d'un anticorps monoclonal IgG anti-G, tel que Bugger deux. En raison de la taille relativement importante des billes PAS.

Utilisez une pipette munie d'une pointe coupée P 200 pour transférer le PAS du lixiviat à 20 % vers des tubes d'échantillons. Placez les échantillons sur une roue rotative verticale et incubez-les au moins deux heures avec une rotation constante. Ensuite, éliminez les protéines non liées du culot d'anticorps PAS en centrifugeant les échantillons une minute dans une centrifugeuse réfrigérée.

À 10 000 G, laver le culot deux fois en ajoutant un millilitre de tampon TEGM, en vortexant, puis en centrifugeant. Éliminer le dernier lavage à l’aide d’une pointe de pipette P 200 pliée pour dissocier l’HSB 90 endogène du culot immuno-précipité de GR, puis ajouter 355 microlitres de tampon TEG et 45 microlitres de chlorure de sodium à cinq molaire à l’anticorps. Culot PAS préparé précédemment.

Placer les échantillons sur une roue tournante verticale et incuber pendant une heure et demie avec une rotation constante. Éliminer les protéines non liées du culot immuno en centrifugeant pendant une minute à 10 000 G. Laver les culots une fois avec un millilitre de tampon TEG et une fois avec un millilitre de tampon HEPES à 10 millimolaire, pH 7,4. À l’aide d’une pipette P200 dont la pointe a été recourbée, retirer le liquide de lavage en prenant soin de ne pas perturber le culot.

Pour reconstituer le complexe hétérodimère GR HSB 90, ajouter au culot un mélange contenant 50 microlitres d'une source de chaperonnes moléculaires, telle qu'un lysat de réticulocyte de lapin, et cinq microlitres d'un système de régénération d'ATP. Cette étape suivante est cruciale afin de garantir un mélange adéquat du culot et de la solution de reconstitution. Incuber les échantillons dans un bain-marie à 30 degrés Celsius pendant exactement 20 minutes.

Frapper doucement les tubes toutes les une à deux minutes afin de perturber délicatement le culot et de mélanger la solution de reconstitution. Ajouter un millilitre de tampon TEGM, vortexer et centrifuger à 10 000 Gs pendant une minute. Retirer le surnageant en prenant soin de ne pas perturber le culot.

Répétez le lavage deux fois supplémentaires afin d'identifier les protéines dans le culot reconstitué. Préparez les échantillons pour l'électrophorèse en ajoutant 50 microlitres de tampon d'échantillonnage SDS-PAGE contenant du bêta-mercaptoéthanol. Vortexez les échantillons, puis incubez-les pendant cinq minutes dans un bain-marie bouillant ou dans un bloc chauffant électronique à 100 degrés Celsius.

Centrifuger les échantillons à 10 000 G pendant une minute. Utiliser le surnageant de ces échantillons pour une électrophorèse SDS-PAGE ou sur puces microfluidiques, suivie d'un western blot. L'utilisation d'une pipette P200 avec une pointe évasée pour charger le surnageant permettra de limiter l'aspiration accidentelle du culot.

L'étape suivante consiste à tester le complexe protéique GR-HSP90 pour son activité de liaison aux stéroïdes. À l'aide d'un stéroïde tritié, commencez par ajouter au culot immuno-précipité 47,5 µL de tampon HEM et 2,5 µL de dexaméthasone tritiée à deux micromolaire.

Mélangez délicatement le culot en prenant soin de minimiser la quantité d'échantillon déplacée sur la paroi du tube de microcentrifugeuse. Incubez l'échantillon toute la nuit sans perturbation sur de la glace. Ajoutez un millilitre de tampon TEGM, mélangez délicatement, puis centrifugez à 10 000 ×g pendant une minute.

Jetez le surnageant avec précaution. Il contient du stéroïde tritié non lié. Répétez l'opération pour un total de trois lavages avec le tampon TEGM. Éliminez complètement tout le surnageant à l'issue du dernier lavage.

À l’aide d’une pipette P 200 munie d’une pointe sertie, resuspendre les culots immuno lavés dans 200 microlitres de tampon TEGM et transférer dans des vials de scintillation de 10 millilitres.

Ajoutez 4,8 millilitres de cocktail de scintillation aux vials et vortexez. Enfin, réalisez une spectrométrie de scintillation liquide ; une page SDS représentative et des données de western blot sont présentées ici sur ce gel coloré au kumasi. Le complexe hétéro GR HSB 90 endogène est immunoprécipité à partir du cytosol cellulaire à l'aide d'anticorps anti-GR, et les protéines individuelles co-immunoprécipitées avec le GR sont visualisées et montrées.

Voici des données d'électrophorèse microfluidique Experian représentant des complexes hétéroclades GR HSP 90 reconstitués. La spécificité de l'immunoadsorption du GR est confirmée en remplaçant l'anticorps anti-GR immunoadsorbant par un anticorps non immunogène, même lorsque des quantités excessives sont utilisées. Aucun GR ni aucune chaperonne moléculaire n'est immunoprécipité.

De même, il est possible de confirmer la dissociation de la protéine HSP 90 et d'autres protéines chaperonnes du GR décapé par le sel par immunotransfert des culots immuno-précipités décapés et reconstitués. La chaîne lourde de l'anticorps immunoadsorbant est détectable à la fois par coloration de Kumasi et par immunotransfert, ce qui confirme que des culots immuno-précipités de taille équivalente sont visualisés dans chaque puits. Des données représentatives d'activité de liaison aux stéroïdes du GR immunoadsorbé sont présentées ici à l'aide soit de lysat de réticulocytes, soit de protéines purifiées.

L'activité de liaison des stéroïdes du complexe hétérodimérique GR HSB 90 reconstitué atteint généralement 75 à 100 % du niveau d'activité de liaison endogène du GR HSB 90. Comme pour les données d'électrophorèse, un anticorps non immunisé peut être utilisé à la place de l'anticorps anti-GR comme témoin négatif et pour évaluer la liaison non spécifique du stéroïde tritié. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'électrophorèse bidimensionnelle peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme l'impact des modifications post-traductionnelles de la HSP 90 sur la reconstitution du complexe hétérodimérique et la liaison du stéroïde. Les essais de reconstitution, tels que ceux décrits ici, ont permis aux chercheurs d'explorer la signification fonctionnelle du système de chaperonnes multiprotéiques basé sur HSP 90 et HSP 70, ainsi que son assemblage progressif, en utilisant le récepteur des glucocorticoïdes comme protéine cliente modèle de la HSP 90.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de préparer des complexes protéiques fonctionnels de récepteur aux glucocorticoïdes et de HSP 90 à partir de protéines purifiées issues de lysats cellulaires. Les étapes utilisées incluent la préparation d'un lysat cellulaire contenant le récepteur GR, l'absorption immunitaire du récepteur, l'élimination par le sel des protéines endogènes et la reconstitution du complexe hétérodimérique à l'aide de HSP 90 exogène, de cofacteurs HSP 70 et de cos-chaperonnes.