Name: Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Découvrez la reconstitution biochimique du complexe GR•HSP90 pour étudier la liaison des ligands stéroïdiens. Cette méthode permet d'analyser les exigences en cofacteurs et les effets des composés exogènes.

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Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé accorde GM086822, Hope Institut de cardiologie de sciences fondamentales prix, et le MJ Murdock Charitable Trust Collège programme de recherche scientifique. Sélectionnez réactifs d&#39;électrophorèse et des logiciels d&#39;analyse d&#39;images ont été généreusement offerts par Bio-Rad.

<ol><li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+signaling+protein+function+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery.</a> Exp. Biol. Med. 228, 111-133 (2003).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucocorticoid+receptor+steroid+binding+and+trafficking+by+the+hsp90%2Fhsp70-based+chaperone+machinery%3A+implications+for+clinical+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucocorticoid receptor steroid binding and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery: implications for clinical intervention.</a> Leukemia. 19, 710-712 (2005).</li>
<li>Pratt, W. B., Morishima, Y., Osawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp90+chaperone+machinery+regulates+signaling+by+modulating+ligand+binding+clefts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts.</a> J. Biol. Chem. 283, 22885-22889 (2008).</li>
<li>Dittmar, K. D., Hutchison, K. A., Owens-Grillo, J. K., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+steroid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+assembly+system+of+rabbit+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the steroid receptorhsp90 heterocomplex assembly system of rabbit reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 271, 12833-12839 (1996).</li>
<li>Morishima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hsp+organizer+protein+hop+enhances+the+rate+of+but+is+not+essential+for+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+multiprotein+Hsp90-based+chaperone+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Hsp organizer protein hop enhances the rate of but is not essential for glucocorticoid receptor folding by the multiprotein Hsp90-based chaperone system.</a> J. Biol. Chem. 275, 6894-6900 (2000).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Kanelakis, K. C., Galigniana, M. D., Morishima, Y., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry%2C+abundance%2C+and+functional+significance+of+the+hsp90%2Fhsp70-based+multiprotein+chaperone+machinery+in+reticulocyte+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry, abundance, and functional significance of the hsp90/hsp70-based multiprotein chaperone machinery in reticulocyte lysate.</a> J. Biol. Chem. 276, 30092-30098 (2001).</li>
<li>Dittmar, K. D., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+the+glucocorticoid+receptor+by+the+reconstituted+Hsp90-based+chaperone+machinery.+The+initial+hsp90.p60.hsp70-dependent+step+is+sufficient+for+creating+the+steroid+binding+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Folding of the glucocorticoid receptor by the reconstituted Hsp90-based chaperone machinery. The initial hsp90.p60.hsp70-dependent step is sufficient for creating the steroid binding conformation.</a> J. Biol. Chem. 272, 13047-13054 (1997).</li>
<li>Kanelakis, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+the+hsp70-binding+protein+BAG-1+on+glucocorticoid+receptor+folding+by+the+hsp90-based+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential effects of the hsp70-binding protein BAG-1 on glucocorticoid receptor folding by the hsp90-based chaperone machinery.</a> J. Biol. Chem. 274, 34134-34140 (1999).</li>
<li>Morishima, Y., Kanelakis, K. C., Murphy, P. J. M., Shewach, D. S., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+iterative+ratcheting+of+receptor-bound+hsp70+between+its+ATP+and+ADP+conformations+during+assembly+of+glucocorticoid+receptor.hsp90+heterocomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evidence for iterative ratcheting of receptor-bound hsp70 between its ATP and ADP conformations during assembly of glucocorticoid receptor.hsp90 heterocomplexes.</a> Biochemistry. 40, 1109-1116 (2001).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pifithrin-alpha+inhibits+p53+signaling+after+interaction+of+the+tumor+suppressor+protein+with+hsp90+and+its+nuclear+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pifithrin-alpha inhibits p53 signaling after interaction of the tumor suppressor protein with hsp90 and its nuclear translocation.</a> J. Biol. Chem. 279, 30195-30201 (2004).</li>
<li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation%2Fdeacetylation+of+the+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J. Biol. Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li>
<li>Morishima, Y., Murphy, P. J. M., Li, D. P., Sanchez, E. R., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%C2%95hsp90+heterocomplex+resolves+two+sequential+ATP-dependent+events+involving+first+hsp70+and+then+hsp90+in+opening+of+the+steroid+binding+pocket%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Stepwise assembly of a glucocorticoid receptorhsp90 heterocomplex resolves two sequential ATP-dependent events involving first hsp70 and then hsp90 in opening of the steroid binding pocket.</a> J. Biol. Chem. 275, 18054-18060 (2000).</li>
<li>Pratt, W. B., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+receptor+interactions+with+heat+shock+protein+and+immunophilin+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Rev%22%5BJournal%5D)">Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones.</a> Endocr. Rev. 18, 306-360 (1997).</li>
<li>Bodwell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+phosphorylated+sites+in+the+mouse+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of phosphorylated sites in the mouse glucocorticoid receptor.</a> J. Biol. Chem. 266, 7549-7555 (1991).</li>
<li>Penna, A., Cahalan, M. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting+using+the+Invitrogen+NuPage+Novex+Bis+Tris+minigels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels.</a> J. Vis. Exp. (7), e264-e264 (2007).</li>
<li>Choo, Y. S., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of Protein Ubiquitination.</a> J. Vis. Exp. (30), e1293-e1293 (2009).</li>
<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor%26bull%3BHsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&bull;Hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J. Biol. Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. 389, pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Davis, T. R., Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-FCM%3A+Immunoprecipitation+Detected+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">IP-FCM: Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry.</a> J. Vis. Exp. (46), e2066-e2066 (2010).</li>
<li>Felts, S. J., Karnitz, L. M., Toft, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functioning+of+the+Hsp90+machine+in+chaperoning+checkpoint+kinase+I+%28Chk1%29+and+the+progesterone+receptor+%28PR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Functioning of the Hsp90 machine in chaperoning checkpoint kinase I (Chk1) and the progesterone receptor (PR).</a> Cell Stress Chaperones. 12, 353-363 (2007).</li>
<li>Cintron, N. S., Toft, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+requirements+for+Hsp40+and+Hsp70+in+the+Hsp90+chaperone+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Defining the requirements for Hsp40 and Hsp70 in the Hsp90 chaperone pathway.</a> J. Biol. Chem. 281, 26235-26244 (2006).</li>
</ol>

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L&#39;essai décrit ci-dessus peut être adapté pour tester une multitude de conditions affectant les actions de la machinerie chaperon chaperon hsp90/hsp70-based ainsi que GR contraignante stéroïdes. Il s&#39;agit d&#39;une modification des méthodes précédemment rapporté 4,8,9,17 et est conçu pour tirer profit des progrès récents dans la technologie d&#39;électrophorèse et être accessible à une communauté plus large de recherche. Cofacteurs supplémentaires ou des protéines d&#39;intérêt peut être ajouté à la G...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Cellules d&#39;insectes Sf9 </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> d&#39;expression baculovirus recombinant de souris de GR </td></tr><tr><td> L929 </td><td> ATCC </td><td> LCR-2173 </td><td> endogènes de souris GR préparation cytosol (alternative à l&#39;expression de baculovirus) </td></tr><tr><td> FiGR hybridomes </td><td> ATCC </td><td> LCR-2173 </td><td> pour la préparation de l&#39;ascite contenant des anticorps anti-GR anticorps monoclonal (alternative à purifier BuGR2 anticorps) </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la protéase complète-Mini, de l&#39;EDTA-libres </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11836170001 </td><td></td></tr><tr><td> protéine A-Sepharose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3391 </td><td></td></tr><tr><td> lysat de réticulocytes de lapin </td><td> Hectares vert (Oregon, WI) </td><td></td><td> riche source de machines chaperon endogènes hsp90/hsp70 </td></tr><tr><td> créatine phosphokinase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3755 </td><td> pour l&#39;ATP-régénérant du système </td></tr><tr><td> phosphocréatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7936 </td><td> pour l&#39;ATP-régénérant du système </td></tr><tr><td> d&#39;anticorps de souris anti-GR monoclonaux (BuGR2) </td><td> Pierce / Thermo Scientific </td><td> MA1-510 </td><td> utilisés pour le GR immunoadsorption et des anticorps primaires dans le western blot </td></tr><tr><td> d&#39;anticorps de souris anti-hsp90 monoclonaux (AC88) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-830 </td><td> utilisé comme anticorps primaire en western blot </td></tr><tr><td> anticorps de souris anti-Hsp70 monoclonaux (N27F3-4) </td><td> Enzo Life Sciences </td><td> ADI-SPA-820 </td><td> utilisé comme anticorps primaire en western blot </td></tr><tr><td> IgG de sérum de souris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 038K7690 </td><td> utilisé comme anticorps non immunisées pour le contrôle négatif de immunoadsorption </td></tr><tr><td> IgG anti-souris-peroxydase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4416 </td><td> utilisé comme anticorps secondaire dans l&#39;ouest de buvard </td></tr><tr><td> Système d&#39;électrophorèse microfluidique Experion </td><td> Bio-Rad </td><td> 7007001 </td><td> alternative à la traditionnelle SDS-PAGE </td></tr><tr><td> [1,2,4,6,7 - 3 H] dexaméthasone </td><td> PerkinElmer </td><td> NET1192001MC </td><td> suivez les précautions de sécurité </td></tr></tbody></table>

reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

Hsp90 est une protéine chaperonne essentiel et très abondante moléculaire qui a été trouvé pour régler plus de 150 eucaryotes protéines de signalisation, y compris les facteurs de transcription (par exemple les récepteurs nucléaires, p53) et les protéines kinases (par exemple, Src, Raf, protéine Akt) impliqués dans le cycle cellulaire, tumorigenèse, l&#39;apoptose, la signalisation et les multiples voies de 1,2 eucaryotes. Parmi ces nombreuses «client» pour les protéines HSP90, l&#39;assemblage des récepteurs stéroïdiens • hsp90 complexes est mieux définis (figure 1). Nous présentons ici un récepteur adapté aux glucocorticoïdes (GR) de dosage immuno-précipitation et in vitro GR • La méthode de reconstitution hsp90 qui peut être facilement utilisé pour sonder eucaryotes hsp90 activité fonctionnelle, hsp90 médiée ligand du récepteur de liaison des stéroïdes, et moléculaire exigences cofacteur chaperon. Par exemple, ce test peut être utilisé pour tester HSP90 exigences cofacteur et les effets de l&#39;ajout de composés exogènes au processus de reconstitution. Le GR a été un système particulièrement utile pour étudier parce hsp90 le récepteur doit être lié à hsp90 d&#39;avoir une liaison d&#39;un ligand ouverte fissure qui est accessible à trois stéroïdes. Endogènes, GR unliganded est présent dans le cytoplasme des cellules de mammifères non covalente lié à hsp90. Comme l&#39;a constaté dans le GR endogène • hsp90 hétérocomplexe, la fixation du ligand GR fente est ouverte et capable de liaison des stéroïdes. Si hsp90 dissocie du GR ou si sa fonction est inhibée, le récepteur est incapable de se lier de stéroïdes et nécessite la reconstitution de la GR • hsp90 hétérocomplexe avant l&#39;activité de liaison des stéroïdes est restaurée 4. GR peut être immunoprécipité du cytosol des cellules en utilisant un anticorps monoclonal, et des protéines telles que hsp90 complexé à la GR peut être analysée par western blot. Steroid activité de liaison du GR immunoprécipité peut être déterminée par incubation de la immunopellet avec [3 H] stéroïdes. Des expériences antérieures ont montré hsp90 médiée par l&#39;ouverture de la liaison d&#39;un ligand GR fissure nécessite hsp70, un chaperon moléculaire seconde également essentielle pour la viabilité des cellules eucaryotes. Activité biochimique de hsp90 et hsp70 sont catalysées par des co-chaperon Hop protéines, HSP40, et p23 5. Un chaperon machines multiprotéiques contenant hsp90, hsp70, Hop, et HSP40 endogène sont présents dans le cytoplasme des cellules eucaryotes, et lysat de réticulocytes fournit un chaperon riche source de protéines 6. Dans la méthode présentée, GR est immunoadsorbed du cytosol des cellules et dépouillé de la machinerie chaperon hsp90/hsp70 endogènes en utilisant les conditions du sel doux. Le GR sel extrait est ensuite incubée avec réticulocytes lysat, l&#39;ATP, et K +, ce qui aboutit à la reconstitution de la GR • hsp90 hétérocomplexe et la réactivation de l&#39;activité de liaison des stéroïdes 7. Cette méthode peut être utilisée pour tester les effets de cofacteurs différents chaperon, de nouvelles protéines, et les inhibiteurs de HSP90 expérimentale ou GR afin de déterminer leur importance fonctionnelle sur hsp90 médiée stéroïdes 8-11 contraignant.

Une<em&gt; In vitro</em&gt; Méthode pour préparer fonctionnelle des récepteurs des glucocorticoïdes (GR) • hsp90 complexes protéiques à partir des protéines purifiées et de lysats cellulaires est décrite. La méthode utilise immunoadsorption de recombinaison GR suivie par le sel de décapage et de reconstitution des protéines complexes. L&#39;importance des cofacteurs et les conditions de tampon sont discutées, tout comme les applications de méthodes possibles.

Reconstitution biochimique des récepteurs stéroïdiens • complexes de protéines Hsp90 et la réactivation de la liaison du ligand

Hsp90 est une protéine chaperonne moléculaire essentielle et très abondante dont on a découvert qu'elle régule plus de 150 protéines de signalisation eucaryotes, ...

L'objectif général de cette procédure est de reconstituer biochimiquement un complexe protéique du récepteur de stéroïdes avec la protéine HSB 90 et de réactiver l'activité de liaison du ligand au récepteur de stéroïdes, ce qui peut être utilisé pour tester les besoins en cofacteurs de la HSB 90 ainsi que les effets de l'ajout de composés exogènes au processus de reconstitution. Ceci est réalisé en préparant tout d'abord un cytosol cellulaire contenant des récepteurs glucocorticoïdes fonctionnels. Ensuite, le GR provenant du cytosol cellulaire est immunoadsorbé et endogène.La protéine HSP 90 est dissociée. Ensuite, le complexe hétérodimère GR-HSP 90 est reconstitué à l'aide d'une source exogène d'HSP 90 ainsi que d'autres protéines chaperonnes et facteurs cofacteurs. Enfin, les complexes protéiques reconstitués et leur activité de liaison au ligand sont analysés spécifiquement par des méthodes telles que la migration sur gel SDS-PAGE, le transfert western et des tests de liaison à un ligand radioactif, utilisés pour démontrer la formation du complexe hétérodimère GR-HSP 90 et l'activité de liaison aux stéroïdes.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domain

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