Name: Automatisé dinteraction hydrophobe Chromatographie sur colonne de sélection pour lutilisation dans la purification des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Découvrez une méthode automatisée de chromatographie d'interaction hydrophobe pour sélectionner les colonnes optimales lors de la purification des protéines recombinantes. Cette technique améliore la reproductibilité et réduit la variabilité des résultats.

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Ce travail a été financé par les Instituts nationaux de la santé et de subvention GM086822 National Science Foundation majeure des instruments de recherche de subvention DBI-0960313. Les auteurs tiennent à remercier les Drs. Jon Miyake &amp; Donna Hardy (Bio-Rad) et Jennifer Loertscher (Seattle University) pour leur expertise technique. Sélectionnez réactifs de chromatographie et de l&#39;instrumentation supplémentaire a été généreusement fourni par la société Bio-Rad.

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</ol>

Sélectionnez réactifs de chromatographie et de l&#39;instrumentation supplémentaire ont été offerts par Bio-Rad.

Les techniques de chromatographie liquide se sont avérés inestimables pour la préparation de protéines hautement purifiées nécessaires à la conduite 6 immunologiques, biochimiques 7, 8 et structurelles des études. Méthodes de purification HIC nécessitent le plus souvent la détermination empirique d&#39;un milieu privilégié, et la structure du ligand, la densité de ligand, et de la matrice des propriétés de perles ont toutes été montré à influer sur les résultats chromatographiques 2, 3. Colonne automatisé le scoutisme est une approche efficace pour la sélection d&#39;un support pour l&#39;optimisation ultérieure HIC et 4 de purification des protéines. La méthode de la colonne automatisé dépistage présenté peut être facilement adaptée à différents HIC stratégies de purification des protéines. Les modifications de la concentration en sel, le choix du sel, gradient de sel, et le pH peut en outre améliorer les conditions de purification, et les effets de la variation de ces paramètres essentiels ont déjà été examinés 13,14. Éluat contenant une HIC prote cible partiellement purifiéen peut encore être purifié en utilisant une technique de chromatographie en phase complémentaire, tels que chromatographie échangeuse d&#39;ions (IEX) ou filtration sur gel / chromatographie d&#39;exclusion de taille 9,10. En raison de son absorption de la lumière unique et des caractéristiques d&#39;émission, le profil d&#39;élution de la GFP peut être identifié à l&#39;aide en ligne et de post-terme des approches. À cette fin, ce protocole peut en outre être adaptée pour la purification de recombinants GFP-protéines de fusion, dans laquelle une protéine cible est sans rapport avec &quot;tag&quot; avec la GFP. Protéines cibles GFP-étiquette peut être détectée avec une lumière UV et 11 purifiée en utilisant diverses méthodes chromatographiques, y compris la stratégie de purification HIC décrit ci-dessus. Purification GFP est également devenu un aliment de base dans les laboratoires de biochimie pédagogique pour l&#39;enseignement des techniques modernes de la science des protéines 12. Alors que de base de purification des protéines HIC peut être effectuée en utilisant une chromatographie sensiblement moins robuste sytige, l&#39;instrumentation présentée ici possède un certain nombre d&#39;avantages distincts pour aider à l&#39;obtention de résultats favorables. Avantages notables de l&#39;utilisation d&#39;un système hautement automatisé comprennent l&#39;amélioration de fonctionner à fonctionner condition de reproductibilité, de gain de temps, et une diminution des possibilités de l&#39;air d&#39;être introduites dans le système 10. Buffer blending système contrôlé, qui est facilitée par le système Maximizer, permet une plus grande cohérence dans la préparation du tampon et de la reproductibilité expérimentale. Dessin de charge d&#39;échantillon suffisante dans la boucle d&#39;échantillonnage dynamique pour tous dépistage exécute en outre assure l&#39;uniformité de l&#39;échantillon étant ajouté à chaque colonne et permet pistes séquentielles sans interruption ou manuel de rechargement. Injection de l&#39;échantillon contrôlé à partir de la boucle d&#39;échantillonnage sur la colonne diminue la variabilité qui peut se produire avec un chargement manuelle de l&#39;échantillon. Une paire de soupapes de sélection de colonne pour permettre pistes consécutives, chacune échantillon en utilisant une colonne différente HIC, sans avoir à replumb le système. Exécution mul<html> ti-longueur d&#39;onde d&#39;analyse est particulièrement bénéfique lors du dosage d&#39;une protéine avec un profil unique spectrophotométrique. En plus de la GFP, les cytochromes, flavoprotéines et autres hème contenant des protéines peuvent bénéficier de cette technique. Dispositifs de surveillance de la conductivité et le pH permettent de vérifier en temps réel des conditions expérimentales. Collecte de l&#39;éluat de Split fraction permet une manipulation fraction améliorée et permet le transfert facile pour les méthodes d&#39;analyse post-terme qui nécessitent un volume d&#39;échantillon minime (par exemple ELISA, SDS-PAGE, western blot, et Experion microfluidique électrophorèse). Pendant le fonctionnement de la seconde fraction déconnecté collecteur nécessite une synchronisation manuelle, il permet une flexibilité maximale dans le choix collecteur de fractions. Les inconvénients les plus importants à l&#39;utilisation d&#39;un tel système de chromatographie robuste pour la colonne HIC le scoutisme et la purification des protéines incluent le temps initial et les dépenses budgétaires liées à l&#39;acquisition instrument et la formation des opérateurs. t &quot;&gt; Le protocole présenté ici utilise un Bio-Rad DuoFlow chromatographie système;. Cependant, l&#39;instrumentation aussi robuste d&#39;autres fabricants, tels que l&#39;Avant ÄKTA de GE Healthcare, peuvent également être utilisés et sont capables de produire des résultats équivalents système de chromatographie Même comparables ont des caractéristiques uniques de programmation (par exemple, la méthode, les limites nomenclature des composants, préférences de l&#39;opérateur, et l&#39;évolutivité) qui devraient être considérés avant d&#39;entamer une procédure de purification ou de l&#39;acquisition instrument.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">DuoFlow BioLogic Pathfinder 20 Système</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=223301" target="_blank">7602257</a> </td><td> Comprend un système de Maximizer, mélangeur, poste de travail F10, AVR7-3 de soupape, UV Quadtec / détecteur de Vis avec cellule d&#39;écoulement, collecteur de fractions BIOFRAC, logiciels BioLogic, et kit de démarrage </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">AVR9-8-flux Sélectionnez la vanne</a><html></td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-0408&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7600408</a> </td><td> Haut-pression à la valve, 9-port, en position 8, 3500 psi (233 bars) limite, pour une utilisation avec un système DuoFlow BioLogic </td></tr><tr><td> Vanne de dérivation SV3T-2 </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> 7600410 </td><td> Electrovanne, 3-port, en position 2, 30 psi (2 bars) limite, pour une utilisation avec un système DuoFlow BioLogic </td></tr><tr><td> Volet clapet de répartition </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td></td><td></td></tr><tr><td>tique = LSR &amp; parentCategoryGUID = 22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; DynaLoop 25 Kit </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0451&vertical=LSR&parentCategoryGUID=22c495f1-36ff-44a3-9140-ee7e54d0b1ba" target="_blank">7500451</a> </td><td> Glisse-piston kit boucle d&#39;échantillonnage, comprend 25 ml DynaLoop coulissant boucle piston, kit de pièces DynaLoop (# 750-0450) </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">Collecteur de fraction BIOFRAC</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/LSR/PDP/ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e/BioFractrade_Fraction_Collector" target="_blank">7410002</a> </td><td> Deux col fraction<html> lecteurs utilisés </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">BIOFRAC microplaque adaptateur de tête goutte</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=741-0088&vertical=LSR&parentCategoryGUID=ec82e7b4-919e-428b-ac03-9adf1f50a48e" target="_blank">7410088</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&vertical=LSR&country=US&lang=en&productID=741-0017" target="_blank">Adaptateur BIOFRAC plaque de microtitration</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>&amp; Country = Etats-Unis &amp; lang = fr &amp; ProductID = 741-0017 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7410017 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">Optique UV Module</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=750-0202&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c140016b-1958-4a91-be4c-8645a4c8204f" target="_blank">7500202</a> </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=catProductDetail&isFromSearch=true&productID=760-1331&vertical=LSR&parentCategoryGUID=c4095dc1-9260-4431-b066-823b050048c8" target="_blank">Lampe halogène</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> &lt;<html> un target = &quot;_blank&quot;&gt; 7601331 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">Econo dégradé la pompe</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=220901" target="_blank">7319001</a> </td><td> une pompe à gradient pour la purification de protéines à basse pression, et un kit de tube comprend raccords </td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224301" target="_blank">Experion système</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td>bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad? cmd = BRCatgProductDetail &amp; ProductID = 224301 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; 7007001 </td><td></td></tr><tr><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">Kit Experion Analyse Pro260</a> </td><td> <a href="http://www.bio-rad.com/" target="_blank">Bio-Rad</a> </td><td> <a href="https://www.bio-rad.com/prd/en/US/adirect/biorad?cmd=BRCatgProductDetail&productID=224101" target="_blank">7007102</a> </td><td></td></tr><tr><td> HiTrap kit HIC sélection de la colonne </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-4110-07 </td><td> Comprend 7 x 1 ml pré-emballés colonnes des médias HIC pour le scoutisme </td></tr><tr><td> Raccords de GE Healthcare colonne à Bio-Rad </td><td> GE Healthcare </td><td> 18111251 18111257 et </td><td></td></tr></tbody></table>

automatisé d&#39;interaction hydrophobe chromatographie sur colonne de sélection pour l&#39;utilisation dans la purification des protéines

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

Contrairement à d&#39;autres méthodes chromatographiques pour les protéines purification (filtration sur gel, par exemple, l&#39;affinité et l&#39;échange d&#39;ions), chromatographie d&#39;interaction hydrophobe (HIC) nécessite souvent la détermination expérimentale (dénommé dépistage ou &quot;scouting&quot;) afin de sélectionner le support le plus approprié par chromatographie en phase pour purifier une protéine donnée 1. La méthode présentée ici décrit une approche automatisée pour le scoutisme pour un média optimales HIC à être utilisés dans la purification des protéines. HIC sépare les protéines et autres biomolécules à partir d&#39;un lysat brut basée sur les différences de caractère hydrophobe. Semblable à la chromatographie d&#39;affinité (AC) et chromatographie échangeuse d&#39;ions (IEX), CIH est capable de concentrer la protéine d&#39;intérêt à mesure qu&#39;elle progresse dans le processus chromatographique. Protéines qui conviennent le mieux pour la purification par HIC comprennent ceux qui sont avec les régions de surface hydrophobes et capables de résister à l&#39;exposition au sel concentrations supérieures à 2 M munitionssulfate de titane ((NH 4) 2 SO 4). HIC est souvent choisi comme un procédé de purification des protéines qui n&#39;ont pas un marqueur d&#39;affinité, et donc impropres à AC, et quand IEX ne parvient pas à fournir de purification adéquate. Fractions hydrophobes sur la surface de la protéine temporairement se lier à un ligand non polaire couplé à une inerte, matrice immobile. L&#39;interaction entre la protéine et le ligand sont fortement tributaires de la concentration en sel de la mémoire tampon qui coule à travers la colonne de chromatographie, avec de fortes concentrations ioniques renforcement de l&#39;interaction protéine-ligand et de faire la protéine immobile (c.-à-lié à l&#39;intérieur de la colonne) 2. Sous forme de sel concentrations diminution, l&#39;interaction protéine-ligand se dissipe, la protéine est de nouveau mobile et est éluée de la colonne. Plusieurs médias HIC sont disponibles dans le commerce pré-emballés colonnes, chacune contenant plusieurs ligands hydrophobes (par exemple S-butyle, butyle, octyle, et phényl) réticulé à différentes densités de billes d&#39;agarose d&#39;un specdiamètre ific 3. Colonne automatisé dépistage permet une approche efficace pour déterminer quels médias HIC devrait être utilisée pour de futures expériences d&#39;optimisation, les plus exhaustives et purification des protéines fonctionne 4. La protéine spécifique se purifier ici est une protéine recombinante fluorescente verte (GFP), mais l&#39;approche peut être adaptée pour la purification d&#39;autres protéines avec une ou plusieurs régions de surface hydrophobes. GFP sert une protéine modèle utile, en raison de sa stabilité, unique pic d&#39;absorbance de lumière à 397 nm et la fluorescence lorsqu&#39;ils sont exposés à la lumière UV 5. Lysat bactérien contenant la GFP de type sauvage a été préparé dans un tampon riche en sel, chargé dans un Bio-Rad moyennes DuoFlow système de pression chromatographie en phase liquide, et adsorbés sur des colonnes HiTrap HIC contenant différents médias HIC. La protéine a été élue des colonnes et analysées par en ligne et les méthodes de détection post-terme. Mélange tampon, dynamique boucle d&#39;injection de l&#39;échantillon, col séquentiellelonne de sélection, multi-longueur d&#39;onde d&#39;analyse et de collecte de l&#39;éluat scission fraction augmenté la fonctionnalité du système et la reproductibilité de la démarche expérimentale.

Procédé automatisé pour identifier appropriés chromatographie d&#39;interaction hydrophobe (HIC) médias à être utilisés dans le procédé de purification de protéine est présenté. La méthode utilise un système de moyenne pression chromatographie en phase liquide, y compris buffer blending automatisé, dynamique boucle d&#39;injection de l&#39;échantillon, sélection de la colonne séquentielle, multi-longueur d&#39;onde d&#39;analyse et de collecte de l&#39;éluat scission fraction.

Automatisé d&#39;interaction hydrophobe Chromatographie sur colonne de sélection pour l&#39;utilisation dans la purification des protéines

Contrairement aux autres méthodes chromatographiques de purification des protéines (par exemple, la filtration sur gel, l'affinité et l'échange d'ions), l'interaction hydrophobe...

L'objectif général de cette procédure est de sélectionner une colonne optimale de chromatographie liquide en phase inverse à l'aide d'une méthode automatisée d'exploration pour la purification d'une protéine recombinante à l'aide d'un système de chromatographie liquide à pression moyenne BioRad DUO flow. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les tampons nécessaires et les lysats bactériens contenant la protéine recombinante d'intérêt. Ensuite, le système de chromatographie duo flow est configuré physiquement, raccordé et préparé pour le protocole d'exploration.Ensuite, les échantillons sont chargés et la méthode programmée d'exploration de colonne HI est exécutée pour recueillir l'échantillon fractionné par EIT. Enfin, l'EIT est analysée et la colonne HI et le milieu optimaux sont identifiés en fonction des caractéristiques de séparation observées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un milieu de colonne HI préféré pour la purification à grande échelle de la protéine d'intérêt du chercheur par chromatographie liquide à pression moyenne, en utilisant les fonctionnalités automatisées d'exploration de colonne HI du système DUO flow.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les séries successives de chromatographie sur colonne manuelle, est que l'automatisation du processus réduit la variabilité et garantit des résultats hautement reproductibles. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de la complexité physique des systèmes modernes de chromatographie liquide. Toutefois, celle-ci peut être facilement maîtrisée.Après une pratique suffisante, la démonstration de la procédure sera effectuée par Orange Stone et Shelly Anderson, deux étudiants de mon laboratoire. Pour commencer, préparez 500 millilitres des tampons suivants : du phosphate de sodium à 200 millimolaire pour le tampon A1, du phosphate monosodique de sodium à 200 millimolaire pour le tampon A2, et du sulfate d'ammonium à 4,8 molaire. Pour le tampon B2, de l'eau déionisée servira de tampon B1. Dégazez les tampons afin d'assurer des conditions optimales de fonctionnement chromatographique. Le système Maximiser mélangera les tampons A1 et A2 pour produire un tampon de élution au phosphate à faible concentration saline, et il mélangera les tampons B1 et B2 pour produire un tampon au sulfate d'ammonium à forte concentration saline.Amorce du tampon. Préparer 20 millilitres d'échantillon à charger en mélangeant 10 millilitres de lysat cellulaire contenant la protéine à purifier avec 10 millilitres du tampon B deux. La concentration finale en sulfate d'ammonium de la solution d'échantillon de lysat cellulaire doit être d'environ 2,4 molaire, ce qui la rend approximativement équivalente au tampon d'amorce.Filtrer le mélange de tampon lysat à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre à faible liaison aux protéines afin d’éliminer les matières particulaires de la solution. Conserver l’échantillon sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être chargé dans le système. La configuration physique et la tuyauterie du système de chromatographie constituent l’un des aspects les plus complexes de cette procédure.Installez le système de chromatographie à flux double selon le schéma indiqué ici. Assurez-vous que des volumes suffisants de tampon sont disponibles pour l'ensemble du protocole et que les tubulures resteront constamment immergées. Raccordez la vanne de chargement de l'échantillon et la boucle d'échantillonnage dynamique comme illustré ici, puis reliez la boucle d'échantillonnage à l'entrée de la vanne d'échantillonnage à la position trois.Préparez huit paires identiques de tubes capillaires d’un diamètre extérieur de 1/16 de pouce. Ensuite, reliez les paires aux positions une à huit des deux vannes de sélection de colonne. Après avoir allumé les lampes du détecteur UV et confirmé que tous les détecteurs sont étalonnés, fixez la vanne séparateur de flux du collecteur de fractions et son contrôleur de séparateur comme illustré ici.Le sélecteur de fractionnement à deux positions et son contrôleur sont utilisés indépendamment de la station de chromatographie. Régler le pourcentage de fractionnement à 10. Remplacer la tête de goutte à fractionnement standard du collecteur de fractions à la position deux par une tête de goutte pour microplaque.Rincez la boucle d'échantillonnage et purgez le système de chromatographie. Ensuite, démarrez un débit manuel de un millilitre par minute de tampon d'élution à travers le système. Connectez des colonnes piège haute capacité de un millilitre aux positions deux à huit des vannes de sélection de colonne.Retirez le raccord reliant les vannes de sélection de colonne de la position deux. Fixez les raccords de colonne en amont au duo flow. Faites circuler le tampon d'élution à travers les raccords jusqu'à ce que tout l'air soit expulsé et qu'une grande goutte de tampon soit présente.Ensuite, retirez le bouchon relié à l'entrée de la colonne et déposez une grande goutte de tampon à faible force ionique sur le dessus de la colonne. Puis, fixez la colonne aux raccords en amont. Connectez la sortie aux raccords de la colonne en aval et au tube du robinet de sélection.Régler la limite de pression arrière à 40 lb/po². Laver la colonne avec cinq volumes de colonne d’un tampon d’élution à un débit de un millilitre par minute. Laver la colonne avec 10 volumes de colonne de tampon de départ à un débit de un millilitre par minute.Une fois que les tracés UV du pH et la pression arrière se sont stabilisés, basculer manuellement les vannes de sélection de colonne en position un et arrêter l'écoulement du tampon. Pour charger un échantillon, immerger le tube d'entrée d'échantillon dans l'échantillon de 20 millilitres. Ensuite, commuter la vanne de lavage de la boucle d'échantillonnage en position un et la vanne de chargement d'échantillon en position purge.Activer la pompe de chargement de la boucle d'échantillonnage afin d'aspirer l'échantillon dans le tube de la pompe à un débit de un millilitre par minute, jusqu'immédiatement après que l'échantillon atteigne la vanne de chargement. Basculer la vanne de chargement d'échantillon de la position purge vers la position chargement. Redémarrer la pompe de chargement de la boucle d'échantillonnage à un débit de un millilitre par minute jusqu'à ce que 10 millilitres d'échantillon aient été aspirés dans la boucle d'échantillonnage dynamique depuis la fenêtre de configuration du logiciel biologic.Sélectionnez les appareils système marqués d'un astérisque dans ce tableau. Ensuite, sélectionnez six colonnes de CIE pour le programme d'essai. Un gradient linéaire descendant de sel et une méthode exploratoire à six colonnes lancent manuellement le débit du tampon de départ à un millilitre par minute.Appuyez sur démarrer sur le contrôleur du séparateur pour commencer immédiatement le fractionnement du flux EIT de 90 % à 10 % dès le lancement de la méthode du programme ; appuyez sur démarrer sur le panneau de commande à l'écran du collecteur de fractions en ligne à 96 puits. Observez l'affichage en temps réel pour confirmer les paramètres prévus de l'expérience. Comparez le tracé d'absorbance spécifique de la GFP à 397 nanomètres au tracé d'absorbance des protéines générales à 280 nanomètres afin d'estimer la séparation et la purification relatives à l'aide des différents milieux HI testés. Des aliquotes de cinq à 50 microlitres provenant des fractions du plateau à 96 puits peuvent être transférées dans un nouveau plateau et analysées pour leur teneur en protéines spécifiques par ELISA ou immunotransfert, ainsi que pour leur teneur totale en protéines par électrophorèse SDS-PAGE ou à l'aide d'un système d'électrophorèse microfluidique Experion. La conductivité représentative du gradient de sel et la pression dans la colonne lors des essais de criblage sont indiquées ici.La variation de la concentration en sel, mesurée par le pourcentage de tampon provenant des lignes de tampon à haute concentration salée, est typique de la méthode HI. Lorsque la concentration en sel diminue, les protéines liées à la colonne s'éluent, ce qui se traduit par une conductivité correspondant à la concentration en sel observée ; celle-ci est mesurée en continu immédiatement après les détecteurs quad tech et UV. Le décalage entre le gradient de sel et les tracés de conductivité indique le temps nécessaire au tampon pour parcourir le système depuis l'entrée du tampon jusqu'au moniteur de conductivité.Pendant toute la durée de l'analyse, la pression du système et le pH restent relativement constants. Cette figure montre les chromatogrammes d'exécutions consécutives de repérage sur colonne HI avec détection en ligne des protéines totales. La NGFP est réalisée en mesurant l'absorbance de la lumière à 280 nanomètres et à 397 nanomètres respectivement.Il est possible d'approximer l'abondance relative de GFP et la séparation pour chaque essai préliminaire. En comparant les deux courbes de cette figure, les tubes de culture des fractions 10, 12, 14, 16 et 18 de l'essai préliminaire de FF de fenouil ont été visualisés sous lumière ambiante ou fluorescente, et les tubes observés en lumière ultraviolette ont été examinés à la fois de face et par-dessus afin d'observer le spectre d'émission caractéristique de la GFP ; celle-ci est clairement détectée dans la fraction 14. Sur les deux images UV, le bleu diffus dans le panneau UV gauche correspond à la lumière émise par la lampe UV.Ces données postérieures à la course correspondent bien à la détection en ligne de la GFP en mesurant l'absorbance de l'éluat à 397 nanomètres, ce qui identifie également la fraction 14 comme contenant le pic principal de la GFP mentionnée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le western blot, les ELISA, la microscopie à force atomique et les essais de reconstitution biochimique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à la pureté et à l'activité fonctionnelle de la protéine purifiée.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit la nécessité d'un contrôle manuel du système de flux dual à plusieurs étapes de la méthode. Parmi les exemples figurent le remplissage des tampons et le chargement des échantillons, la vérification de la présence de bulles d'air, ainsi que l'activation et la désactivation des lampes de détection selon les besoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment utiliser un système de chromatographie liquide pour effectuer une exploration automatisée afin de déterminer les colonnes et milieux HI optimaux.L'analyse en ligne et sur support permettra à un chercheur de sélectionner une colonne appropriée pour la purification à plus grande échelle, qui pourrait également être combinée à d'autres méthodes chromatographiques afin d'augmenter la pureté et le rendement de la protéine cible.

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