Automatisé d'interaction hydrophobe Chromatographie sur colonne de sélection pour l'utilisation dans la purification des protéines

L'objectif général de cette procédure est de sélectionner une colonne optimale de chromatographie liquide en phase inverse à l'aide d'une méthode automatisée d'exploration pour la purification d'une protéine recombinante à l'aide d'un système de chromatographie liquide à pression moyenne BioRad DUO flow. Cela est réalisé en préparant tout d'abord les tampons nécessaires et les lysats bactériens contenant la protéine recombinante d'intérêt. Ensuite, le système de chromatographie duo flow est configuré physiquement, raccordé et préparé pour le protocole d'exploration.

Ensuite, les échantillons sont chargés et la méthode programmée d'exploration de colonne HI est exécutée pour recueillir l'échantillon fractionné eit. Enfin, l'EIT est analysé et la colonne HI et le milieu optimaux sont identifiés en fonction des caractéristiques de séparation observées. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent un milieu de colonne HI préféré pour la purification à grande échelle de la protéine d'intérêt du chercheur par chromatographie liquide à pression moyenne, en utilisant les capacités automatisées d'exploration de colonne HI du système DUO flow.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les séries successives de chromatographies sur colonne manuelles, est que l'automatisation du processus réduit la variabilité et garantit des résultats hautement reproductibles. En général, les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés en raison de la complexité physique des systèmes modernes de chromatographie liquide. Toutefois, celle-ci peut être facilement maîtrisée.

Après un entraînement suffisant, la démonstration de la procédure sera effectuée par Orange Stone et Shelly Anderson, deux étudiants de mon laboratoire. Commencez par préparer 500 millilitres des tampons suivants : du phosphate de sodium à 200 millimolaire pour le tampon A1, du phosphate de sodium à 200 millimolaire pour le tampon A2, et du sulfate d'ammonium à 4,8 molaire. Pour le tampon B, l'eau désionisée servira de tampon B1. Dégazez les tampons afin d'assurer des conditions optimales de fonctionnement chromatographique. Le système Maximizer mélangera les tampons A1 et A2 afin de produire un tampon de élution au phosphate faible en sel, et mélangera les tampons B1 et B2 afin de produire un tampon riche en sel de sulfate d'ammonium.

Amorce du tampon. Préparer 20 millilitres d'échantillon à charger en mélangeant 10 millilitres de lysat cellulaire contenant la protéine à purifier avec 10 millilitres de tampon B deux. La concentration finale en sulfate d'ammonium de la solution d'échantillon de lysat cellulaire doit être d'environ 2,4 molaire, ce qui la rend approximativement équivalente au tampon d'amorce.

Filtrer le mélange de tampon de lyse à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre à faible liaison aux protéines afin d’éliminer les matières particulaires de la solution. Garder l’échantillon sur glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être chargé dans le système. La configuration physique et la tuyauterie du système de chromatographie constituent l’un des aspects les plus complexes de cette procédure.

Installez le système de chromatographie à flux double selon le schéma indiqué ici. Assurez-vous que des volumes suffisants de tampon sont disponibles pour l'ensemble du protocole et que les tubulures resteront constamment immergées. Raccordez la vanne de chargement de l'échantillon et la boucle d'échantillonnage dynamique comme illustré ici, puis reliez la boucle d'échantillonnage à l'entrée de la vanne d'échantillonnage à la position trois.

Préparez huit paires identiques de tubes capillaires d’un diamètre extérieur de 1/16 de pouce. Ensuite, reliez les paires aux positions une à huit des deux vannes de sélection de colonne. Après avoir allumé les lampes du détecteur UV et confirmé que tous les détecteurs sont étalonnés, fixez la vanne séparatrice de flux du collecteur de fractions et son contrôleur de séparateur comme illustré ici.

Le sélecteur de fractionnement de la position deux et son contrôleur sont utilisés indépendamment de la station de chromatographie. Régler le pourcentage de fractionnement à 10. Remplacer le dispositif standard de réception des fractions sur le collecteur de la position deux par un dispositif de réception pour microplaque.

Rincez la boucle d'échantillonnage et purgez le système de chromatographie. Ensuite, démarrez un débit manuel de un millilitre par minute de tampon d'élution à travers le système. Connectez des colonnes piège haute capacité de un millilitre aux positions deux à huit des vannes de sélection de colonne.

Retirez le raccord reliant les vannes de sélection de colonne de la position deux. Fixez les raccords de colonne en amont au duo flow. Faites circuler le tampon d'élution à travers les raccords jusqu'à ce que tout l'air soit expulsé et qu'une grande goutte de tampon soit présente.

Ensuite, retirez le bouchon relié à l'entrée de la colonne et déposez une grande goutte de tampon à faible concentration saline sur le dessus de la colonne. Puis, fixez la colonne aux raccords en amont. Connectez la sortie aux raccords de la colonne en aval et au tube du robinet de sélection.

Régler la limite de pression arrière à 40 lb/po². Laver la colonne avec cinq volumes de colonne d’ tampon d’élution à un débit de un millilitre par minute. Laver la colonne avec 10 volumes de colonne de tampon de départ à un débit de un millilitre par minute.

Une fois que les tracés UV du pH et la pression arrière se sont stabilisés, passer manuellement les vannes de sélection de colonne en position un et arrêter l'écoulement du tampon. Pour charger un échantillon, plonger le tube d'entrée d'échantillon dans l'échantillon de 20 millilitres. Ensuite, commuter la vanne de lavage de la boucle d'échantillonnage en position un et la vanne de chargement d'échantillon en purge.

Activer la pompe de chargement de la boucle d'échantillonnage afin d'aspirer l'échantillon dans le tube de pompe à un débit de un millilitre par minute, jusqu'immédiatement après que l'échantillon atteigne la vanne de chargement. Basculer la vanne de chargement d'échantillon de la position purge à la position chargement. Redémarrer la pompe de chargement de la boucle d'échantillonnage à un débit de un millilitre par minute jusqu'à ce que 10 millilitres d'échantillon aient été aspirés dans la boucle d'échantillonnage dynamique depuis la fenêtre de configuration du logiciel biologic.

Sélectionnez les appareils système marqués d'un astérisque dans ce tableau. Ensuite, sélectionnez six colonnes HIC pour le programme d'essai. Un gradient linéaire descendant de sel et une méthode exploratoire à six colonnes lancent manuellement le débit du tampon de départ à un millilitre par minute.

Appuyez sur démarrer sur le contrôleur du séparateur pour commencer immédiatement la séparation du flux EIT de 90 % à 10 % dès le lancement de la méthode du programme ; appuyez sur démarrer sur le panneau de commande à l'écran du collecteur de fractions en plaque 96 puits hors ligne. Observez l'affichage en temps réel pour confirmer les paramètres prévus de l'expérience. Comparez le tracé d'absorbance spécifique de la GFP à 397 nanomètres au tracé d'absorbance des protéines générales à 280 nanomètres afin d'estimer la séparation et la purification relatives à l'aide des différents milieux HI testés. Des aliquotes de cinq à 50 microlitres provenant des fractions de la plaque 96 puits peuvent être transférées dans une plaque neuve et analysées pour leur teneur en protéines spécifiques par ELISA ou immunotransfert, et pour leur teneur totale en protéines par électrophorèse SDS-PAGE ou à l'aide d'un système d'électrophorèse microfluidique Experion. La conductivité représentative du gradient de sel de hick et la pression de colonne des expériences de criblage sont indiquées ici.

La variation de la concentration en sel, mesurée par le pourcentage de tampon provenant des lignes de tampon à haute salinité, est typique de la méthode HI. Lorsque la concentration en sel diminue, les protéines liées à la colonne s'éluent ; la conductivité, qui correspond à la concentration en sel observée, est mesurée en continu immédiatement après les détecteurs Quad Tech et UV. Le décalage entre le gradient de sel et les tracés de conductivité indique le temps nécessaire au tampon pour parcourir le système depuis l'entrée du tampon jusqu'au moniteur de conductivité.

Pendant toute la durée de l'analyse, la pression du système et le pH restent relativement constants. Cette figure montre les chromatogrammes d'analyses préliminaires successives sur colonne HI avec détection en ligne de la protéine totale. La NGFP est réalisée en mesurant l'absorbance de la lumière à 280 nanomètres et à 397 nanomètres respectivement.

Il est possible d'approximer l'abondance relative de GFP et la séparation pour chaque essai préliminaire. En comparant les deux courbes de cette figure, les tubes de culture des fractions 10, 12, 14, 16 et 18 de l'essai préliminaire FF de fenouil ont été visualisés sous lumière ambiante ou lumière fluorescente, et les tubes observés en lumière ultraviolette ont été examinés à la fois de face et par-dessus afin d'observer le spectre d'émission caractéristique de la GFP ; celle-ci est clairement détectée dans la fraction 14. Sur les deux images UV, le bleu diffus dans le panneau UV gauche correspond à la lumière émise par la lampe UV.

Ces données postérieures à la course correspondent bien à la détection en ligne de la GFP par mesure de l'absorbance à 397 nanomètres, qui identifie également la fraction 14 comme contenant le pic principal de la GFP suggérée. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que le western blot, les tests ELISA, la microscopie à force atomique et les dosages de reconstitution biochimique peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires relatives à la pureté et à l'activité fonctionnelle de la protéine purifiée.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit la nécessité d'un contrôle manuel du système de flux dual à plusieurs étapes de la méthode. Cela inclut le remplissage des tampons et le chargement des échantillons, la vérification de la présence de bulles d'air, ainsi que l'activation et la désactivation des lampes de détection selon les besoins. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de l'utilisation d'un système de chromatographie liquide pour effectuer une exploration automatisée afin de déterminer les colonnes et milieux HI optimaux.

L'analyse en ligne et l'analyse préliminaire permettront à un chercheur de sélectionner une colonne appropriée pour la purification à plus grande échelle, qui pourra éventuellement être combinée à d'autres méthodes chromatographiques afin d'augmenter la pureté et le rendement de la protéine cible.