Isolement magnétique de la microglie à partir du cerveau d’un bébé souris

Les microglies – les macrophages résidant dans le cerveau – expriment CD11b, une intégrine de surface cellulaire.

Pour isoler la microglie du cerveau de petits souris, prélevez des fragments de cerveau dans des tubes de dissociation contenant un tampon contenant de la papaïne, une enzyme protéolytique, et de la désoxyribonucléase.

Placez les tubes sur un dissociateur mécanique. Pendant la course, le dissociateur perturbe mécaniquement les tissus.

La papaïne digère la matrice extracellulaire du tissu, libérant des cellules, y compris la microglie, en suspension. La désoxyribonucléase dégrade l’ADN libre en suspension, empêchant ainsi l’isolement cellulaire inefficace.

centrifugeuse. Complétez la dissociation mécanique par pipetage. Transférez la suspension à travers une passoire cellulaire pour éliminer les débris et les amas cellulaires, et obtenir une population unicellulaire homogène.

Incuber avec des microbilles superparamagnétiques fonctionnalisées avec des anticorps anti-CD11b. Les microbilles se lient spécifiquement à CD11b sur les cellules, y compris la microglie.

Post-incubation, centrifugeuse. Retirez le surnageant contenant les billes non liées. Résuspendez les cellules dans la mémoire tampon. Charger sur une colonne placée sur un séparateur magnétique. La colonne est constituée d’une matrice avec des billes ferromagnétiques.

Lorsqu’elles sont placées sur le séparateur, les sphères à l’intérieur de la colonne amplifient le champ magnétique, retenant les cellules CD11b+ liées aux microbilles à l’intérieur de la colonne, tandis que d’autres cellules s’écoulent.

Retirez-le du séparateur et utilisez un tampon pour éluer les cellules CD11b+ de la colonne. Centrifuger la suspension et remettre en suspension les cellules CD11b+ dans un milieu microglial.

Les cellules isolées sont prêtes pour une analyse plus approfondie.

Préparez le mélange de dissociation selon ce tableau. Transférez 12 morceaux de cerveau dans un tube en C pour un poids total de 1,2 gramme par tube de dissociation. Ensuite, placez les tubes C sur le dissociateur avec chauffage. Démarrez le programme NTDK optimisé dans le dissociateur. Centrifugez pendant 20 secondes. Complétez la dissociation mécanique en pipetant trois fois.

Transférez les cellules dans quatre tubes de 15 millilitres avec des crépines attachées. Rincez les passoires avec 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium. Centrifugez pendant 10 minutes et retirez le surnageant à l’aide d’une pipette de 10 millilitres. Avec précaution, ajoutez 10 millilitres de HBSS avec du calcium et du magnésium, et remettez la pastille en suspension. Encore une fois, centrifugez et retirez le surnageant.

Remettez le granulé en suspension avec 6 millilitres de tampon de tri. Répétez la centrifugation et jetez le surnageant. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution de microbilles CD11b et incubez les tubes pendant 15 à 20 minutes à 4 degrés Celsius. Après l’incubation, remettre en suspension la pastille avec 6 millilitres de tampon de tri. Répétez la centrifugation et remettez le granulé en suspension avec 8 millilitres de tampon de tri.

Ensuite, suivez le programme POSSEL sur le séparateur pour préparer huit colonnes. Passez les cellules dans la colonne en ajoutant 1 millilitre de suspension cellulaire à la fois. Avec 1 millilitre de tampon de tri, éluer les cellules CD11b positives sur une plaque d’élution stérile. Regroupez les cellules dans un tube de 50 millilitres.

Centrifugez et remettez en suspension la pastille avec 10 millilitres de milieu microglial froid. Comptez les cellules CD11b positives. Remettez les cellules en suspension dans un milieu microglial froid pour obtenir une concentration finale de 650 000 à 700 000 cellules par millilitre.