Visualisation de l’activation de la caspase dans des macrophages dérivés de monocytes humains

Dans les cellules immunitaires, la caspase-1, une caspase inflammatoire, est un composant immunitaire clé qui existe sous une forme inactive. Ces formes inactives consistent en une fusion pro-domaine avec un domaine catalytique et deviennent actives par dimérisation induite par proximité.

Pour visualiser l’activation de la caspase in vivo, commencez par une culture de macrophages dérivés de monocytes humains transfectés exprimant des protéines fluorescentes rouges et une paire de protéines rapporteures de complémentation fluorescente. Les protéines rapporteures contiennent un pro-domaine de la caspase-1 fusionnée avec des fragments non fluorescents de la protéine Vénus, soit Venus-N ou Venus-C.

Traitez les cellules avec un milieu d’imagerie contenant des lipopolysaccharides - un stimulant inflammatoire dérivé de bactéries, et des ionophores potassiques - la nigéricine.

Les lipopolysaccharides interagissent avec les récepteurs de reconnaissance de formes sur le macrophage, initiant l’assemblage d’un complexe d’inflammasome.

Les molécules de nigéricine pénètrent dans la cellule et se lient aux ions potassium, provoquant leur efflux dans le milieu extracellulaire et diminuant la concentration d’ions potassium intracellulaires. Cela conduit à l’amorçage des protéines capteurs de l’inflammasome avec des protéines adaptatrices - une protéine de pont entre la protéine capteur et la procaspase-1, formant le complexe.

Les pro-domaines contenant des fragments de Vénus interagissent avec les protéines adaptatrices du complexe. Cela rapproche les deux fragments, les forçant à se replier et à devenir fluorescents.

Visualisez les cellules au microscope à épifluorescence.

Les cellules transfectées apparaissent rouges avec des taches de fluorescence vertes, confirmant l’activation de la caspase.

Prenez un microtube stérile de 1,5 millilitre par transfection et ajoutez le plasmide rapporteur approprié et les plasmides de caspase-BiFC dans la hotte. Placez la station de pipette, l’appareil, les pointes, les tubes d’électroporation et la pipette dans une hotte à flux laminaire stérile. Connectez et allumez le dispositif de nucléotion.

Entrez les paramètres de transfection dans l’écran de démarrage qui s’affiche. Appuyez sur Voltage, entrez 1 000 et appuyez sur Terminé pour le régler sur 1000 volts. Appuyez sur Largeur, entrez 40 et appuyez sur Terminé pour régler l’impulsion sur 40 millisecondes. Enfin, appuyez sur # Pulses, entrez deux, puis appuyez sur Terminé pour régler le nombre d’impulsions électriques sur 2.

Prenez l’un des tubes d’électroporation et remplissez-le de trois millilitres de tampon électrolytique E à température ambiante. Insérez le tube d’électroporation dans le support de pipette de la station de pipette, en vous assurant que l’électrode sur le côté du tube est tournée vers l’intérieur et qu’un clic se fait entendre lorsque le tube est inséré.

Prenez la pastille cellulaire et ajoutez 10 microlitres de tampon R de remise en suspension préchauffé pour chaque 1 à 2 fois 10 à la cinquième cellule, et mélangez doucement avec une micropipette P20. Ajoutez 10 microlitres de suspension cellulaire dans chaque tube de transfection et mélangez doucement avec une micropipette P20. Insérez une pointe dans la pipette en appuyant sur le bouton-poussoir jusqu’à la deuxième butée, en vous assurant que la pince saisit complètement la tige de montage du piston dans la pointe.

Ensuite, appuyez sur le bouton-poussoir de la pipette jusqu’à la première butée, puis plongez dans le premier tube contenant un mélange d’ADN cellulaire ou plasmidique pour aspirer l’échantillon. Insérez très soigneusement la pipette avec l’échantillon dans le porte-pipette, en vous assurant que la pipette s’enclenche et est correctement placée. Appuyez sur Start sur l’écran tactile et attendez que les impulsions électriques soient délivrées.

Lentement, retirez la pipette de la station et ajoutez immédiatement la suspension cellulaire transfectée dans le puits correspondant avec le milieu préchauffé et sans antibiotiques en appuyant lentement sur le bouton-poussoir jusqu’à la première butée. Secouez doucement la plaque avec des cellules transfectées et incubez pendant une à trois heures dans un incubateur de culture de tissus humidifié. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de milieu de culture préchauffé dans chaque puits.

Placez la parabole dans l’incubateur et laissez au moins 24 heures pour l’expression des gènes. Le lendemain, inspectez la viabilité cellulaire et l’efficacité de la transfection à l’aide d’un microscope à épifluorescence.

Retirez soigneusement le milieu des cellules à l’aide d’une micropipette P1000 et ajoutez 500 microlitres de la solution de stimulation sur le côté du puits. Pour faire fonctionner des puits de contrôle non traités, ajoutez un milieu d’imagerie sans le stimulus.

Pour visualiser les cellules à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou d’un microscope confocal, allumez le microscope et la source de lumière fluorescente, en suivant les instructions du fabricant. Sélectionnez l’objectif 10 fois ou 20 fois et placez la boîte de culture sur la platine du microscope.

Trouvez les cellules sous le filtre de 568 nanomètres avec l’oculaire et concentrez-vous sur les cellules exprimant les globules rouges rapporteurs. Comptez tous les globules rouges dans le champ visuel. Dans le même champ visuel, passez aux filtres 488 ou 512. Comptez le nombre de globules rouges qui sont également verts. Comptez au moins 100 globules rouges d’au moins trois champs.