Évaluation de la colite induite par des produits chimiques par l’analyse immunohistochimique de coupes de tissu du côlon

Chez la souris, la couche muqueuse du côlon est constituée de cellules immunitaires contenant une lamina propria, entourée d’un épithélium serré qui protège la muqueuse. Le traitement chimique au sulfate de sodium dextran perturbe les jonctions serrées, causant des dommages aux cellules épithéliales et permettant aux microbes luminaux de pénétrer dans la lamina propria.

La

reconnaissance microbienne dans le côlon déclenche la sécrétion de chimiokines, entraînant l’infiltration des cellules immunitaires et la libération de cytokines pro-inflammatoires. Cette réponse immunitaire exagérée entraîne une inflammation du côlon ou une colite.

Pour évaluer la colite induite par des produits chimiques, commencez par utiliser une lame de verre portant une section de tissu du côlon de souris fixe et prétraitée présentant une colite induite par des produits chimiques. Traitez la section avec un cocktail d’anticorps primaires spécifiques aux récepteurs des cellules immunitaires qui se lient à leurs cellules immunitaires respectives.

Laver pour éliminer les anticorps non liés. Incuber la section de tissu avec des anticorps secondaires biotinylés, qui se lient spécifiquement aux anticorps primaires. Incuber avec les conjugués streptavidine-enzyme, qui interagissent avec les biotines, formant des complexes.

Recouvrir la section de tissu d’un substrat chromogène ; l’interaction enzyme-substrat confère une coloration brune aux cellules immunitaires. Contre-colorez la section avec un colorant à l’hématoxyline pour colorer les noyaux cellulaires.

Observez la lame colorée au microscope. L’abondance de cellules immunitaires brunes dans la zone endommagée indique une colite induite par des produits chimiques.

Pour l’analyse immunohistochimique, après avoir chauffé les sections pendant 20 minutes sur la plaque chauffante, laver les lames trois fois dans du PBS pendant 10 minutes par lavage, et éliminer la peroxydase endogène avec une incubation de peroxyde d’hydrogène à 3 % pendant 10 minutes.

À la fin de l’incubation, laver les échantillons trois fois dans du PBS comme démontré, et bloquer toute liaison non spécifique avec un tampon de blocage, pendant au moins une heure à température ambiante. Ensuite, remplacez le tampon de blocage par le cocktail d’anticorps primaire d’intérêt pour une incubation nocturne à 4 degrés Celsius.

Le lendemain matin, aspirez l’excès de solution d’anticorps primaires et lavez les lames trois fois dans du PBS. Après le dernier lavage, incubez les lames avec le cocktail d’anticorps secondaires biotinylés approprié, suivi d’un marquage avec le complexe de peroxydase de raifort streptavidine à température ambiante.

Pour visualiser les cellules immunoréactives, étiquetez les échantillons avec du DAB jusqu’à ce qu’une couleur brun clair ou foncé se développe et contre-colorez les sections avec de l’hématoxyline et de l’ammoniac dilué à 0,3 %.

Lorsque les lames ont séché, utilisez un microscope optique pour obtenir des images en fond clair des coupes de tissus sous un grossissement de 10 fois, et utilisez un programme de traitement d’images pour identifier et quantifier la population des cellules immunitaires marquées dans l’épithélium et la lamina propria.