Destruction des cellules K562 par les cellules mononucléées du sang périphérique exposées à des préparations de produits du tabac

Les cellules tumorales activent les cellules immunitaires effectrices pour libérer des cytokines et des granules cytolytiques contenant de la perforine et des granzymes. La perforine forme des pores dans la membrane cellulaire tumorale, facilitant l’entrée du granzyme dans la cellule et initiant l’apoptose, provoquant la mort cellulaire.

Pour analyser la fonction cytolytique des cellules mononucléées du sang périphérique humain, les PBMC, après la préparation du produit du tabac, l’exposition au TPP, prendre une plaque multi-puits avec des concentrations croissantes de TPP. Un puits contenant du milieu agit comme le contrôle.

Ajouter la suspension PBMC. Le principal agent immunosuppresseur des TPP, la nicotine, se lie aux récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine des PBMC effecteurs, régulant à la baisse la production de cytokines pro-inflammatoires.

centrifugeuse. Retirez le surnageant contenant du TPP. Remettre les PBMC en suspension dans les médias. Ajouter aux puits des cellules K562 marquées par fluorescence, des cellules leucémiques humaines ayant une sensibilité accrue à la cytotoxicité des cellules effectrices PBMC.

Les

cellules effectrices traitées au TPP avec des réponses immunitaires supprimées présentent une expression réduite de la perforine et une libération de cytokines, diminuant la capacité cytolytique du PBMC.

centrifugeuse. Remettez les cellules en suspension dans un tampon suivi d’un colorant fluorescent imperméable aux cellules. Le colorant pénètre dans les cellules dont les membranes sont compromises et colore l’ADN.

À l’aide d’un cytomètre en flux, déterminez la proportion de cellules K562 mortes et vivantes dans les puits. Un pourcentage plus faible de cellules K562 mortes dans les puits avec des concentrations de TPP plus élevées que le témoin indique la suppression de la destruction des cellules K562 par les PBMC traités par TPP.

Après avoir préparé une plaque de PBMC traités à des produits du tabac, comme nous venons de le démontrer, laver une culture de cellules K562 récoltées à une confluence de 80 % dans 10 millilitres de DPBS. Remettez la pastille en suspension dans 5 millilitres de DPBS et comptez les cellules. Ensuite, ajoutez 1 millilitre de solution de travail CFSE fraîchement préparée à 1 à 2 fois 10 à la septième cellules K562 dans 1 millilitre de milieu complet, et dispersez la coloration cellulaire par vortex.

Incuber les cellules à température ambiante. Après exactement 2 minutes, ajoutez 200 microlitres de FBS et vortex à nouveau les cellules, en les incubant pendant deux minutes supplémentaires.

Après la deuxième incubation, laver les cellules dans 10 millilitres de milieu complet. Ensuite, mettez la pastille en suspension dans 10 millilitres supplémentaires de milieu complet et comptez les cellules. Maintenant, centrifugez les PBMC traités au tabac et décantez le surnageant. Ensuite, remettez le couvercle en suspension, remettez les cellules en suspension par vortex et lavez-les dans 200 microlitres de milieu complet par puits.

Pour amorcer l’essai de destruction, ajoutez les cellules K562 marquées au CFSE aux PBMC dans un rapport de 1 à 15, et incubez la co-culture à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2.

Après cinq heures, faites tourner les cellules et jetez le surnageant. Remettez les granulés en suspension par vortex, puis lavez les cellules avec 200 microlitres de tampon par puits. Ensuite, ajoutez 95 microlitres de tampon courant suivis de 5 microlitres de 7-AAD, pour un volume total de 100 microlitres par puits.

Enfin, incubez les cellules dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes, puis ajoutez 100 microlitres de tampon de coulée dans chaque puits et transférez tout le volume dans les tubes FACS correspondants appropriés pour déterminer le pourcentage de cellules 7-AAD et CFSE-positives par analyse cytométrique en flux.