Microscopie intravitale pour analyser les interactions cellules sanguines-endothéliales dans un modèle murin d’inflammation

Commençons avec une souris anesthésiée à laquelle on a injecté par voie intrapéritonéale du lipopolysaccharide pour induire une inflammation.

Inciser l’abdomen pour exposer la cavité abdominale. Maintenez l’hydratation des organes avec une solution saline. Injecter la rhodamine 6G de manière rétro-orbitale. Les molécules de colorant fluorescent entrent dans la circulation et marquent les leucocytes et les plaquettes pour leur visualisation.

Maintenant, extériorisez une boucle d’iléon avec ses vaisseaux mésentères. Gardez les tissus hydratés avec une solution saline préchauffée pour une imagerie optimale. Sous un microscope à fluorescence, focus sur une veine de mésentère pour la microscopie intravitale.

L’injection de lipopolysaccharides provoque l’activation des cellules endothéliales avec la régulation positive des molécules d’adhésion, y compris les sélectines. Les plaquettes circulantes sont recrutées dans l’endothélium, où elles se lient via des interactions molécule-ligand d’adhésion spécifiques, formant des complexes d’adhésion.

En raison de ces interactions, les plaquettes s’activent et libèrent des granules contenant des molécules, dont la sérotonine, favorisant le recrutement des leucocytes.

Les leucocytes se déplacent vers la surface endothéliale et se lient aux plaquettes activées. De plus, les leucocytes roulent le long de l’endothélium et se lient aux cellules endothéliales par de faibles interactions adhésives. Le mouvement de roulement active les intégrines leucocytaires pour une adhésion ferme aux cellules endothéliales, cruciale pour la transmigration leucocytaire-endothélial.

À l’aide de la microscopie intravitale, visualisez les leucocytes et les plaquettes fluorescents pour déterminer leurs interactions en temps réel avec les cellules endothéliales.

Quatre heures avant l’imagerie intravitale, injectez 20 milligrammes par kilogramme de LPS IP dans une souris mâle de 16 à 20 grammes âgée de 4 à 6 semaines pour induire la réponse inflammatoire bactérienne simulée.

Préchauffez une solution saline à 0,9 % dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pour humidifier la chambre en plastique et le tissu du mésentère à ce moment-là également. Ensuite, confirmez la profondeur appropriée de l’anesthésie par une absence de réponse au pincement des orteils chez la souris traitée par LPS, puis appliquez une pommade sur les yeux de l’animal.

Épilez l’abdomen avec un rasoir, en enlevant tous les poils morts avec de la gaze imbibée à 70 % d’éthanol. Ensuite, utilisez une petite pince incurvée et des ciseaux pour ouvrir l’abdomen.

Identifiez les vaisseaux épigastricaux et ouvrez le péritoine dans la région de la linea alba pour protéger les vaisseaux. Appliquez quelques gouttes de solution saline préchauffée dans la cavité abdominale pour garder les tissus humides, suivies d’une injection rétro-orbitaire de 50 microlitres de rhodamine 6G pour marquer les cellules sanguines circulantes. Ensuite, placez la souris dans une boîte de Pétri de 10 centimètres, extériorisez une boucle d’iléon et administrez la solution saline préchauffée toutes les deux minutes pour garder le tissu humide.

Pour visualiser la réponse inflammatoire par microscopie intravitale, placez la souris sous le microscope et amenez dans le champ de vision une veine de mésentère d’un diamètre de 200 à 300 micromètres et le moins possible de graisse environnante visible.

À l’aide du logiciel de microscope approprié, enregistrez les interactions cellules sanguines-endothéliales pendant 1 minute dans 4 veines différentes par souris. Ensuite, pour analyser les réponses de cellule à cellule, confirmez les conditions de flux sanguin stables et interindividuelles.

Pour quantifier le nombre de leucocytes roulants, tracez une ligne verticale à travers la veine et comptez manuellement tous les leucocytes qui traversent cette ligne en 1 minute. Pour déterminer la vitesse de roulement, tracez deux lignes verticales à travers la veine à 50 micromètres de distance et mesurez le temps qu’il faut à un seul leucocyte pour traverser entre les lignes tout en roulant de manière stable sur l’endothélium.

Pour mesurer l’adhérence leucocytaire, tracez un carré de 200 par 200 micromètres dans la veine. Ensuite, comptez manuellement les leucocytes fermement adhérents qui ne présentent aucun mouvement visible à l’intérieur du carré pendant 30 secondes. Enfin, pour quantifier les interactions plaquettes-leucocytes, comptez manuellement le nombre de plaquettes liées à un leucocyte.