Induction de la maladie du greffon contre l’hôte dans des modèles murins par greffe allogénique de moelle osseuse et de cellules spléniques

Commencer avec une souris receveuse anesthésiée préalablement irradiée pour supprimer le système immunitaire de l’hôte.

Obtenez des cellules souches hématopoïétiques d’une souris donneuse génétiquement différente pour imiter une greffe de cellules souches allogéniques.

Retirez les lymphocytes T du donneur à l’aide de billes magnétiques.

Injectez cette suspension appauvrie en lymphocytes T dans l’espace rétrobulbaire de la souris receveuse.

Les cellules transplantées pénètrent dans la circulation sanguine, migrent vers les vaisseaux de la moelle osseuse et utilisent des molécules d’adhésion pour pénétrer dans la niche, initiant l’hématopoïèse.

Injecter des lymphocytes T spléniques d’une souris donneuse allogénique dans l’espace rétrobulbaire du receveur pour induire une réactivité immunitaire croisée.

Ces lymphocytes T alloréactifs migrent vers divers tissus.

Les récepteurs de surface des lymphocytes T se lient aux antigènes des cellules réceptrices, les reconnaissant comme étrangers.

Cela déclenche une cascade d’événements de signalisation au sein des lymphocytes T, conduisant à leur activation.

Les lymphocytes T activés déclenchent une cascade inflammatoire caractérisée par le recrutement de cellules immunitaires supplémentaires qui endommagent collectivement les tissus de l’hôte, conduisant au développement de la maladie du greffon contre l’hôte.

Un jour après l’irradiation corporelle totale des souris BALB/c réceptrices, placez un CD45.1/Ly5.1 B6. souris donneuse SJL en position couchée sur une gaine de travail propre, et utilisez une pointe incurvée et dentelée de 13 centimètres d’une pince Semken pour soulever la fourrure à un talon d’Achille.

À l’aide de ciseaux fins durcis de 8,5 centimètres avec des pointes droites, incisez la peau entre la pince et un talon, en allongeant l’incision crânienne pour faciliter l’élimination de la peau et de la fourrure des membres postérieurs. Lorsque la peau a été retirée des membres postérieurs, coupez à travers chaque articulation de la hanche, de la cheville et du genou.

Rangez la cuisse et le jarret de chaque membre postérieur dans une seule boîte de Pétri de 92 millimètres remplie de PBS sur de la glace, et retirez soigneusement autant de muscle que possible de chaque os, en transférant chaque fémur et tibia nettoyés dans un tube de 50 millilitres de milieu stérile RPMI 1640 sur de la glace humide.

Pour isoler la moelle osseuse, transférez un os à la fois dans une nouvelle boîte de Pétri de 92 millimètres remplie de milieu frais RPMI 1640 et utilisez un scalpel pour couper les extrémités de chaque os. Ensuite, utilisez une seringue de 1 millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26 pour rincer les os avec un millilitre de milieu frais à la fois dans un tube de prélèvement de 50 millilitres contenant cinq millilitres de milieu.

Lorsque tous les os ont été rincés, pipetez doucement les morceaux de moelle osseuse friables de haut en bas plusieurs fois pour générer une suspension unicellulaire. Avant de filtrer les cellules à travers une crépine de 40 micromètres dans un nouveau tube de collecte de 50 millilitres, granulez les cellules par centrifugation et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de tampon de chlorure d’ammonium et de lyse potassique pour une incubation de trois minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, arrêtez la réaction avec 10 millilitres de PBS et centrifugez à nouveau les cellules.

Remettre la pastille en suspension dans deux millilitres de PBS frais pour le comptage et réserver une aliquote 6 x 10⁶ cellules pour l’analyse cytométrique en flux en aval. Ensuite, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce pour épuiser magnétiquement les lymphocytes T CD90.2 positifs de la suspension monocellulaire de la moelle osseuse conformément aux instructions du fabricant, et réservez une aliquote de 1 x 10⁶ cellules de l’éluat appauvri en lymphocytes T pour l’analyse cytométrique en flux en aval de la pureté et de la composition de la cellule avant et après la séparation.

Ensuite, à l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 30, injectez 5 x 10 cellules de^moelle osseuse appauvries en 5 lymphocytes T et 100 microlitres de PBS par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbaire du sinus veineux de chaque animal receveur irradié.

Le lendemain, placez une rate prélevée sur un animal donneur sur une passoire à mailles de 40 micromètres dans un tube de prélèvement de 50 millilitres, et utilisez un piston de seringue pour presser le tissu de la rate à travers la passoire dans le tube. Lavez la crépine et le piston avec du PBS pour recueillir tous les splénocytes et granulez les cellules par centrifugation, après la lyse des globules rouges, comme démontré. Remettez les globules blancs en suspension pour le comptage et réservez une aliquote de 6 x 10⁶ cellules pour l’analyse cytométrique en flux en aval.

Pour isoler les lymphocytes T CD3 positifs totaux des splénocytes totaux, utilisez un kit de purification cellulaire disponible dans le commerce conformément aux instructions du fabricant, et réservez une aliquote de lymphocytes T CD3 positifs 1 x 10⁶ de la fraction cellulaire positive pour l’analyse cytométrique en flux en aval de la pureté et de la composition des cellules, avant et après la séparation. Ensuite, injectez 7 x 10⁵ lymphocytes T CD3 positifs alloréactifs et 100 microlitres de PBS par voie intraveineuse dans l’espace rétrobulbaire de chaque souris receveuse pour induire la GvHD.