Name: Cell Transplantation intraspinale pour le ciblage du col corne ventrale de la sclérose latérale amyotrophique et les lésions de la moelle épinière (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Apprenez la transplantation intraspinale de cellules précurses neurales pour cibler la corne ventrale cervicale chez les modèles rongeurs de SLA et de lésion de la moelle épinière. Cette méthode permet d'étudier la survie et l'intégration cellulaires.

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Je tiens à remercier: tous les membres du Lepore, Maragakis et les laboratoires Rothstein à la discussion utile; La Paralyzed Veterans of America et la Fondation Craig H. Nielsen pour le financement.

<ol><li>Lane, M. A., Fuller, D. D., White, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Trends in neurosciences. 31, 538-538 (2008).</li>
<li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin. Chest. Med. 15, 675-675 (1994).</li>
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<li>Tandan, R., Bradley, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+leteral+sclerosis%3A+Part+2.+Etiopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic leteral sclerosis: Part 2. Etiopathogenesis.</a> Annals of neurology. 18, 419-419 (1985).</li>
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<li>Bruijn, L. I., Becher, M. W., Lee, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-327 (1997).</li>
<li>Gurney, M. E., Pu, H., Chiu, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
<li>Howland, D. S., Liu, J., She, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+loss+of+the+glutamate+transporter+EAAT2+in+a+transgenic+rat+model+of+SOD1+mutant-mediated+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS).</a> Proc Natl Acad Sci. 99, 1604-1604 (2002).</li>
<li>Nagai, M., Aoki, M., Miyoshi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+expressing+human+cytosolic+copper-zinc+superoxide+dismutase+transgenes+with+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+associated+mutations+develop+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rats expressing human cytosolic copper-zinc superoxide dismutase transgenes with amyotrophic lateral sclerosis: associated mutations develop motor neuron disease.</a> J. Neurosci. 21, 9246-9246 (2001).</li>
<li>McDonald, W., Becker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury%3A+promising+interventions+and+realistic+goals%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Phys.+Med.+Rehabi%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury: promising interventions and realistic goals.</a> Am. J. Phys. Med. Rehabi. I82, S38-S38 (2003).</li>
<li>Sandrow-Feinberg, H. R., Zhukareva, V., Santi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+interferon-beta+modulates+the+acute+inflammatory+response+and+recovery+when+combined+with+forced+exercise+following+cervical+spinal+contusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+neurology%22%5BJournal%5D)">PEGylated interferon-beta modulates the acute inflammatory response and recovery when combined with forced exercise following cervical spinal contusion injury.</a> Experimental neurology. 223, 439-451 (2010).</li>
<li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1433 (2000).</li>
<li>Lane, M. A., Lee, K. Z., Fuller, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+circuitry+and+respiratory+recovery+following+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+physiology+%26+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Spinal circuitry and respiratory recovery following spinal cord injury.</a> Respiratory physiology & neurobiology. 169, 123-123 (2009).</li>
<li>Lepore, A. C., Rauck, B., Dejea, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature. 11, 1294-1294 (2008).</li>
<li>Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+and+Restricted+Precursors+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Multipotent and Restricted Precursors in the Central Nervous System.</a> Anat Rec. 257, 137-137 (1999).</li>
<li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial-+restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Glial- restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Dev Biol. 188, 48-48 (1997).</li>
<li>Suzuki, M., Tork, C., Shelley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS.+Sexual+dimorphism+in+disease+onset+and+progression+of+a+rat+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Amyotroph+Lateral+Scler%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS. Sexual dimorphism in disease onset and progression of a rat model of ALS.</a> Amyotroph Lateral Scler. 8, 20-20 (2007).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., Gasmi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain research. 1185, 256-256 (2007).</li>
<li>Veldink, J. H., Bar, P. R., Joosten, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+differences+in+onset+of+disease+and+response+to+exercise+in+a+transgenic+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Sexual differences in onset of disease and response to exercise in a transgenic model of ALS.</a> Neuromuscul Disord. 13, 737-737 (2003).</li>
<li>Shumsky, J. S., Lepore, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Neuronal+and+Glial+Restricted+Precursors+into+Contused+Spinal+Cord+Improves+Bladder+and+Motor+Functions%2C+Decreases+Thermal+Hypersensitivity%2C+and+Modifies+Intraspinal+Circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Neuronal and Glial Restricted Precursors into Contused Spinal Cord Improves Bladder and Motor Functions, Decreases Thermal Hypersensitivity, and Modifies Intraspinal Circuitry.</a> J. Neurosci. 25, 9624-9624 (2005).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pour les études impliquant souris SOD1 G93A et les rats, l&#39;âge et le sexe correspondre les animaux dans un groupe, et de distribuer les animaux au sein de la même portée à des groupes différents. Il est préférable d&#39;utiliser tous les animaux du même sexe à la fois pour la SLA et les modèles de SCI, car les processus pathologiques peuvent différer entre les mâles et les femelles, mais il peut également être utile d&#39;avoir suffisamment d&#39;animaux des deux sexes pour détecter d&#39;éventuels effets...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Le numéro de catalogue </td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14170 </td></tr><tr><td> Trypsine 0,05% </td><td> Gibco </td><td> 25300 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de trypsine de soja (facultatif) </td><td> Sigma </td><td> T-6522 </td></tr><tr><td> Maléate d&#39;acépromazine (0,7 mg / kg) </td><td> Fermenta Santé Animale </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine (95 mg / kg) </td><td> Fort Dodge Animal Health </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (10 mg / kg) </td><td> Bayer </td><td></td></tr><tr><td> # 11 lames Feather chirurgicale </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 72044-11 </td></tr><tr><td> Coton-tige (6 pouces) </td><td> Fisher </td><td> 23-400-101 </td></tr><tr><td> Dents de rat pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> Rat: 11023-15; Souris: 11042-08 </td></tr><tr><td> Des ciseaux à ressort de taille moyenne </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15012-12 </td></tr><tr><td> Mini ciseaux à ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15000-10 </td></tr><tr><td> Rongeur </td><td> Outils Fine Science </td><td> Rat: 16121-14; Souris: 16221-14 </td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Outils Fine Science </td><td> 10056-12 </td></tr><tr><td> Porte-aiguilles </td><td> Outils Fine Science </td><td> 12502-14 </td></tr><tr><td> Suture: 4-0 </td><td> Vicryl </td><td> S-183 </td></tr><tr><td> Staples: 9 mm </td><td> Autoclip </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> Agrafeuse: 9 mm (Reflex # 203-1000) </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> 5000344 </td></tr><tr><td> Pompe à eau chaude (T / pompe) </td><td> Gaymar </td><td> P / N 07999-000 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A: 250,0 ml ampoules mg/5.0 </td><td> Novartis / Sandimmune </td><td> NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FK-506 </td><td> Laboratoires LC </td><td> F-4900 </td></tr><tr><td> La rapamycine </td><td> Laboratoires LC </td><td> R-5000 </td></tr><tr><td> Injecteur </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> UMP2 </td></tr><tr><td> Micro 4 Contrôleur de pompe Microseringue </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> UMC4 </td></tr><tr><td> Micromanipulateur </td><td> Instruments de précision du monde </td><td> Kite-R </td></tr><tr><td> 10,0 seringue Hamilton uL </td><td> Hamilton </td><td> 80030 </td></tr><tr><td> Aiguilles Hamilton: 33-jauge, biseau à 45 °, 1 pouce </td><td> Hamilton </td><td> 7803-05 </td></tr><tr><td> Verre 20,0 uL pipettes microcapillaires (facultatif) </td><td> Kimble </td><td> 71900-20 </td></tr></tbody></table>

cell transplantation intraspinale pour le ciblage du col corne ventrale de la sclérose latérale amyotrophique et les lésions de la moelle épinière

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Compromis respiratoire due à la perte des neurones moteurs phrénique est une conséquence débilitante d&#39;une grande proportion de lésions de la moelle humaine traumatisante épinière (SCI) des cas 1 et est la cause ultime de la mort chez les patients atteints du trouble du neurone moteur, la sclérose amyotrophique latérales (ALS) 2. La SLA est une maladie neurologique dévastatrice qui se caractérise par une dégénérescence relativement rapide du supérieur et les neurones moteurs inférieurs. Les patients en fin de compte succomber à la maladie, en moyenne 2-5 ans après le diagnostic en raison de la paralysie respiratoire due à une perte de neurones moteurs innnervation phrénique du diaphragme 3. La grande majorité des cas sont sporadiques, tandis que 10% sont de la forme familiale. Environ vingt pour cent de cas familiaux sont liés à des mutations ponctuelles dans le gène de diverses Cu / Zn superoxyde dismutase 1 (SOD1) sur le chromosome 21 4. Les souris transgéniques 4,5 et 6 portant des rats mutants SOD1 humaine gènes (G93A, G37R, G86R, G85R) ont été générés, et, malgré l&#39;existence de modèles animaux autres la perte des neurones moteurs, sont actuellement les modèles les plus utilisés de la maladie . Lésion de la moelle épinière (SCI) est un ensemble hétérogène de conditions résultant d&#39;un traumatisme physique à la moelle épinière, avec des résultats fonctionnels variant selon le type, la localisation et la sévérité de la blessure 7. Néanmoins, environ la moitié des cas de SCI humaines affectent les régions cervicale, entraînant un dysfonctionnement respiratoire débilitante due à la perte de neurones moteurs phrénique et de blessures aux axones descendant respiratoires bulbospinal 1. Un certain nombre de modèles animaux de la SCI ont été développés, avec le plus couramment utilisé et cliniquement pertinente étant la contusion 8. Transplantation des différentes classes de cellules précurseurs neurales (PNJ) est une stratégie thérapeutique prometteuse pour le traitement des lésions du SNC traumatique et la neurodégénérescence, notamment la SLA et la SCI, en raison de la capacité de remplacer la neuroprotection perdu ou dysfonctionnel types de cellules du SNC, de fournir et livrer des facteurs génétiques d&#39;intérêts 9. Les modèles animaux de la SLA et la SCI peut modéliser de nombreux aspects cliniquement pertinentes de ces maladies, y compris la perte de neurones moteurs phrénique et conséquente de troubles respiratoires, 10,11. Afin d&#39;évaluer l&#39;efficacité des PNJ des stratégies basées sur la fonction respiratoire dans ces modèles animaux de la SLA et la SCI, les interventions cellulaires doivent être spécifiquement destinées à des régions contenant des cibles thérapeutiques pertinentes telles que les neurones moteurs phrénique. Nous fournissons un protocole détaillé pour le multi-segmentaire, la transplantation intraspinale de PNJ dans la moelle épinière ventrale du col de la matière grise des modèles de maladies neurodégénératives telles que les souris SOD1 G93A et les rats, ainsi que des rats blessés médullaires et des souris 11.

La transplantation précurseurs neuraux est une stratégie prometteuse pour protéger et / ou le remplacement perdu / dysfonctionnel cervicale neurones moteurs phrénique des blessures de la moelle épinière (SCI) et les neurones moteurs désordre, la sclérose amyotrophique latérales (SLA). Nous fournissons un protocole pour la livraison de cellule à la corne moelle épinière cervicale ventrale dans des modèles rongeurs de la SLA et la SCI.

Cell Transplantation intraspinale pour le ciblage du col corne ventrale de la sclérose latérale amyotrophique et les lésions de la moelle épinière

L'insuffisance respiratoire due à la perte des motoneurones phréniques est une conséquence débilitante d'une proportion importante de traumatismes médullaires (TM) humains...

L'objectif général de cette procédure est de cibler des transplantations intramédullaires multisegmentaires de cellules souches neuronales vers la moelle épinière cervicale, dans la substance grise ventrale, chez le rat et la souris. Cette opération est réalisée en préparant tout d'abord le type de cellules souches neuronales d'intérêt pour la transplantation. Ensuite, une laminectomie est pratiquée sur la moelle épinière au niveau de chaque site prévu pour la transplantation cellulaire.Ensuite, les cellules sont correctement injectées aux emplacements et profondeurs appropriés afin de cibler précisément la délivrance cellulaire à la corne ventrale de la moelle épinière cervicale. La dernière étape consiste à continuer d'administrer une immunosuppression à l'animal jusqu'à l'euthanasie, afin d'assurer la survie des cellules transplantées dans la moelle épinière. Enfin, des résultats peuvent être obtenus pour suivre la survie, la migration et la différenciation des cellules souches neuronales transplantées dans la moelle épinière cervicale adulte à différents points temporels après la transplantation, grâce à des méthodes histologiques telles que l'immunohistochimie et à une analyse ultérieure par microscopie.La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car de nombreuses étapes complexes de la chirurgie de la moelle épinière et de la transplantation cellulaire sont difficiles à apprendre, car elles exigent une grande précision et des techniques spécifiques, ce qui les rend plus aisées. Si ces procédures recommandées sont appliquées trois jours avant la transplantation, immunosupprimez l'animal en administrant des injections quotidiennes de 10 milligrammes par kilogramme de poids corporel de cyclosporine A par injection sous-cutanée. Si des cellules d'origine rongeur doivent être transplantées, ou un milligramme par kilogramme de poids corporel de FK 5 0 6 et de rapamycine par injection intrapéritonéale.Si des cellules d'origine humaine doivent être transplantées, façonnez également des trombones solides pour former des rétracteurs. Cassez une partie du trombone pour en faire un crochet et courbez l'autre extrémité du trombone en une petite boucle. Ensuite, faites passer un fil à travers la boucle de chaque rétracteur, puis stérilisez au autoclave les rétracteurs et tous les instruments qui seront utilisés lors de la chirurgie le jour de l'intervention.Préparez des aliquotes de cellules progénitrices gliales ou d'autres cellules destinées à être transplantées selon les procédures décrites dans le protocole écrit. Une fois les cellules récoltées, répartissez les suspensions cellulaires dans plusieurs tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et maintenez-les sur de la glace fondante. Ensuite, après avoir administré un anesthésique approprié à l'animal, confirmez qu'un niveau anesthésique adéquat pour la chirurgie a été atteint en effectuant un pincement de l'orteil.Utiliser un rasoir électrique pour raser le dos de l'animal, en rasant soigneusement une zone allant légèrement au-delà des oreilles jusqu'au milieu du dos, puis retirer les poils coupés de la peau afin d'éviter que des poils n'entrent dans l'incision. Ensuite, imbiber un morceau de gaze avec une solution antiseptique à base de povidone iodée et l'appliquer sur la peau de la zone rasée. Frotter au moins deux fois avec la solution antiseptique et deux fois avec de l'alcool ou un désinfectant dilué, selon un mouvement circulaire.Commencer au niveau du site d'incision et progresser vers l'extérieur en direction de la ligne des cheveux. Placer un tampon de gaze stérile roulé sur une planche chirurgicale propre et fixer le tampon sur la planche à l’aide de ruban adhésif afin qu’il ne bouge pas. Placer l’animal au-dessus du tampon de gaze roulé en position fœtale.Étendez les deux membres antérieurs de l'animal sur le coussin, puis fixez-les avec du ruban adhésif sur le coussin et la planche chirurgicale afin de bien exposer la moelle épinière cervicale. Cela facilitera l'intervention chirurgicale, car la moelle cervicale se situe profondément sous la surface de la peau. Une nappe chirurgicale stérile doit être utilisée pendant cette procédure, bien que cela ne soit pas montré dans la vidéo à des fins de démonstration.Commencez par effectuer, sous un microscope chirurgical réglé sur le grossissement le plus faible, une incision médiane à l’aide d’un scalpel stérile et aiguisé, depuis la base du crâne jusqu’aux omoplates. Ensuite, pratiquez une incision à travers les trois couches musculaires recouvrant la colonne vertébrale. Exercez une pression suffisante pour sectionner l’ensemble des couches musculaires en un nombre minimal d’incisions, sans appuyer trop fermement afin d’éviter tout dommage aux tissus profonds, à l’aide de deux applicateurs munis de cotons-tiges.Utilisez un mouvement de torsion pour séparer le muscle superficiel du muscle paravertébral. N'incisez ni ne déchirez le muscle, car cela provoquerait une hémorragie. Placez quatre des rétracteurs maison en position afin de rétracter le muscle.Ensuite, tirez chacun des quatre rétracteurs vers les quatre coins et fixez les ficelles sur la planche pour bien maintenir les rétracteurs. L'exposition finale doit avoir une forme carrée ou rectangulaire. Utilisez des pinces à dents de rat et des ciseaux à ressort de taille moyenne pour retirer les muscles paravertébraux de la surface dorsale des vertèbres.Effectuez les incisions très près de l'os afin d'exposer mieux la surface osseuse. Veillez à ce que les incisions soient parallèles à la surface des vertèbres, mais n'incisez pas jusqu'à la moelle. Remplacez les ciseaux à ressort de taille moyenne par un ciseau à désosser.Ensuite, fixez l'ensemble de la colonne vertébrale en saisissant le muscle recouvrant le processus C2 avec une pince dentée et utilisez la cisaille brute pour écarter le muscle au niveau de C4, C5 et C6. Puis, commencez une laminectomie au niveau de C5. De nouveau, fixez la zone en maintenant C2 avec la pince dentée.Saisir toute la lame avec la pince brute et positionner la lame de manière à ce que l'outil soit parfaitement perpendiculaire à l'axe de la colonne vertébrale. Écraser lentement et délicatement la lame sans appuyer vers le bas dans la moelle épinière. Ensuite, tirer doucement vers le haut le fragment osseux cassé.Ensuite, positionnez le rétracteur brut perpendiculairement à la colonne vertébrale. Insérez ensuite délicatement le rétracteur sous l'os selon un angle de 30 à 60 degrés par rapport à la surface de la moelle. Effectuez de petites incisions pour étendre la laminectomie à toutes les lames de C4 à C6.Ne pas étendre la laminectomie trop latéralement, car cela provoquera un saignement. Augmenter le grossissement du microscope à environ 15 x et focaliser sur la moelle épinière. Utiliser un bistouri droit et pointu.Pince n°5 pour nettoyer le tissu conjonctif situé au-dessus de la dure-mère. Ensuite, utiliser soit des ciseaux miniatures à ressort, soit un microcouteau pour inciser la dure-mère parallèlement à l'axe de la colonne vertébrale. À partir d'un point légèrement médial par rapport à la zone d'entrée des racines dorsales, s'assurer que la dure-mère est perforée au site d'injection.Après avoir percé, le liquide céphalorachidien sortira et séchera la surface de la moelle épinière ; essuyez toute l'aire exposée avec de la gaze ou un applicateur stérile à embout cotonneux. Utilisez une pince pour saisir délicatement la dure-mère et la soulever légèrement sans pincer ni endommager la moelle épinière. Prolongez légèrement l'incision selon l'axe rostral de la moelle à l’aide d’une seringue Hamilton de type gast de 10 microlitres équipée d’une aiguille amovible.Équipée d'une aiguille métallique Hamilton fine de jauge 33 avec une biseau à 45 degrés. Charger lentement le volume requis de suspension cellulaire pour un site d'injection. Abaisser la pointe de l'aiguille vers la surface dorsale de la moelle épinière tout en surveillant son avancement à travers le microscope.Alignez la seringue avec l'axe de la colonne vertébrale afin de cibler correctement la région anatomique souhaitée, en orientant l'aiguille aussi proche que possible de 90 degrés et légèrement médiale par rapport à la zone d'entrée des racines dorsales. Touchez doucement la surface de la moelle épinière avec la pointe de l'aiguille, en comprimant légèrement la moelle épinière à l'aide de la pointe de l'aiguille. Ensuite, retirez l'aiguille jusqu'à ce que la moelle épinière reprenne sa position normale.Enregistrez cette position comme Z égal à 0,0 à l’aide de la règle sur le micromanipulateur. Ensuite, tout en surveillant visuellement l’avancement à travers le microscope, abaissez légèrement l’aiguille dans la moelle épinière. Abaissez l’aiguille de 1,5 millimètre pour cibler la corne ventrale chez un rat adulte.Laisser l'aiguille en place pendant deux à cinq minutes avant de commencer l'injection. Veiller à ce que le dispositif chirurgical reste intact pendant cette période. Ensuite, injecter deux microlitres de cellules en deux à cinq minutes à un débit constant à l'aide du contrôleur de pompe ; après l'injection, laisser l'aiguille en place pendant deux à cinq minutes.Retirez ensuite soigneusement l'aiguille de la moelle épinière. Répétez le processus d'injection pour les autres sites cibles. Une fois tous les sites cibles injectés, revenez au grossissement le plus faible au microscope et effectuez la suture.Fermer simultanément les trois couches musculaires superficielles à l’aide d’un fil 0 pour les muscles en trois points situés le long de l’axe rostral de la corde. Fermer la peau à l’aide de pinces chirurgicales de neuf millimètres, en veillant à espacer les agrafes d’environ 0,5 centimètre. Serrer les agrafes à l’aide d’un porte-aiguille afin d’empêcher l’animal de les arracher avant la cicatrisation complète de la plaie.Appliquer la solution antiseptique au povidone-iodé sur la zone de l'incision à l'aide d'un pansement imbibé et laisser l'animal se réveiller de l'anesthésie sur un tapis chauffant à circulation d'eau. Poursuivre quotidiennement les injections de cyclosporine A ou de FK506 et de rapamycine jusqu'à l'euthanasie. 50 000 souris sont arrivées. Des cellules progénitrices gliales ont été transplantées dans la corne ventrale de la moelle épinière au niveau C4 chez un rat SOD1G93A.Cette image montre que des souris M deux positives ont été utilisées, que les cellules transplantées ont survécu un mois après la transplantation, et que les cellules se sont localisées dans la substance grise ventrale, mais que le site d'injection a manqué médialement la corne ventrale latérale, comme indiqué par la ligne pointillée. Comme on le voit ici, l'injection d'un nombre beaucoup plus élevé de cellules dans cette région entraîne des lésions au site d'injection et le long du trajet de l'aiguille. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ 45 à 60 minutes pour six sites d'injection, si elle est effectuée correctement.

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